已吸用烟头的DNA检验及在案件中的应用研究

烟头的STR分型及应用研究

李发贵，朱少建，汪萍，朱国超，陈祖聪，农明伟

（广西壮族自治区公安厅，广西南宁530012）

【摘要】目的 建立烟头的STR分型的可靠方法，并将建立的方法在案件的检验中应用。方法以酚-氯仿抽提法、5% Chexe-100提取法及5% Chexe-100提取+乙醇沉淀法等三种方法提取烟头烟纸及海绵上唾液斑的DNA，用荧光试剂盒扩增，扩增产物经ABI3100遗传分析仪进行检测分析。结果吸用烟头上的烟纸和海绵上均含有吸用者的DNA，可进行DNA检验，采用三种不同的方法提取64枚烟头的烟纸和海绵上DNA进行STR分型，将检验结果进行统计学分析，酚-氯仿抽提法及5% Chexe-100提取+乙醇沉淀法提取烟头烟纸上的DNA进行STR分型效果较好。结论建立的方法可用于烟头的DNA检验，在法医学鉴定中有较高的应用于价值。

【关键词】烟头 DNA提取 STR分型

利用生物检材进行DNA检验鉴定，是目前常用的重要的破案手段之一，在刑事案件中，生物检材的种类繁多，往往存在于不同的基质中，如何对存在于不同基质中不同类型的生物检材进行DNA检验，一直是法医DNA检验工作者在案件检验中不断遇到并需要解决的实际问题。现场遗留的吸用烟头在刑事案件中是常见的一类生物物证检材，在这类检材上常粘附有唾液斑迹或口唇粘膜印痕，其中含有吸烟者口腔及口唇粘膜脱落细胞，可进行DNA检验。由于烟头上细胞量很少，且存在不明原因的PCR抑制物^[1]，或烟头可能受各种各样的污染，因而如何提取烟头上粘附的脱落细胞的DNA和去除烟头上的PCR抑制物是检验成功与否的关键，本文作者采用三种方法提取烟头上DNA（其中一种方法为作者针对烟头探讨得出的改良方法），就不同方法检验出成功率进行比较，对消除烟头上PCR抑制物的方法作了初步的探讨。

1材料和方法

1.1 样本

不同吸烟者提供的已吸用过滤咀烟头50枚，同一吸烟者提供的同一品牌的已吸用过滤咀烟头14枚，共计64枚。将同一吸烟者提供的14枚烟头中的4枚在干燥的地板踩踏后备检，4枚在不同的湿泥地上踩踏后取出晾干备检，4枚放入有烟丝浸泡液的烧杯中浸泡1小时后取出晾干备检。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取上述64枚烟头，分别剪取嘴接触端约0 .3cm.，分开烟纸和海绵，将烟纸和海绵剪碎后均分成3份（即一枚烟头取材6份，分为a、b、c、d、e、f），分别置于500μl EP管中，编为1a、1b、1c、1d、1e、1f--64a、64b、64c、64d、64e、64f号，按表1所列的方法进行DNA提取。

表1：不同检材DNA提取方法

编号	取材部位	DNA提取方法
1a-64a号	烟纸	酚-氯仿抽提法
1b-64b号	烟纸	Chelex-100提取法
1c-64c号	烟纸	Chelex-100提取+乙醇沉淀法
1d-64d号	海绵	酚-氯仿抽提法
1e-64e号	海绵	Chelex-100提取法
1f -64f号	海绵	Chelex-100提取+乙醇沉淀法

注：表中酚-氯仿抽提法和Chelex-100提取法均按文献[2]操作。

Chelex-100提取+乙醇沉淀法的具体步骤是：先按Chelex-100提取法得到含DNA的上清液，然后取出上清液置于另一EP管中，按酚-氯仿抽提法中用乙醇沉淀DNA方法操作，最终加入20μl TE将已干燥的DNA溶解。

1.2.2扩增及检测

各样本DNA在PE 9700型热循环仪中进行复合扩增，PCR反应参照ABI Profiler plus^TMKit 说明书，扩增产物经ABI 3100遗传分析仪毛细管电泳，Data collection1.01收集信息，GeneScan Analysis3.7和Genotyper3.7软件进行10个基因座等位基因分型。

1.2.3 统计学分析：率的比较采用χ²检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

（1）烟纸10个基因座检出率：受检烟纸64份，酚-氯仿抽提法及Chelex-100提取+乙醇沉淀法均检出62份，检出率为96.88%，Chelex-100法检出58份，检出率为90.63%，两者无显著差异性（χ²=1.2，Ｐ>0.25）。见表2

表2：烟纸10个基因座检出率的比较

DNA提取方法	检验份数	检出10个位点份数	检出率（%）	未检出份数及说明
酚-氯仿抽提¹	64	62	96.88	2份被浸泡
Chelex-100法²	64	58	90.63	4份被浸泡及2份湿泥地踩踏的未检出
Chelex-100提取+乙醇沉淀法	64	62	96.88	2份被浸泡的未检出

注：1与2行四格表校正χ²检验，Ｐ>0.25

（2）海绵10个基因座检出率：受检海绵64份，酚-氯仿抽提法检出60份，检出率为93.75%，Chelex-100法检出34份，检出率为53.13%，Chelex-100提取+乙醇沉淀法检出52份，检出率为81.25%，三者做行X列χ²检验，有显著差异性（χ²=30.3，Ｐ<0.005），三种方法间分别行四格表χ²检验进行两两比较，均有显著差异性（Ｐ<0.05），三种DNA提取方法中，酚-氯仿抽提法最佳，Chelex-100提取+沉淀法次之，Chelex-100法较差。见表3

表3：海绵10个基因座检出率

DNA提取方法	检验份数	检出10个位点份数	检出率（%）	部分位点检出或未检出份数及说明
酚-氯仿抽提¹	64	60	93.75	3份被浸泡及1份湿泥地踩踏的未检出
Chelex-100法²	64	34	53.13	14份检出部分位点，16份未检出（含被浸泡的2份）
Chelex-100提取+沉淀法³	64	52	81.25	10份检出部分位点，2份被浸泡的未检出

注：1、2、3法做行X列χ²检验，P<0.005,1与2、2与3、1与3法分别行四格表χ²检验， P值分别为P<0.001，P<0.005，P<0.05。

（3）Chelex-100法分别对64份烟纸及海绵提取DNA，烟纸检出58份，检出率为90.63%，海绵检出34份，检出率为53.13%，两者有显著差异性（χ²=22.2，Ｐ<0.001）。

（4）烟纸及海绵用不同DNA提取方法处理后的STR分型结果比较见图1。

图1 不同DNA提取方法的STR分型结果比较

a-酚-氯仿抽提的烟纸；b- Chelex-100提取的烟纸；c- Chelex-100提取+乙醇沉淀提取的烟纸； d-酚-氯仿抽提的海绵；e- Chelex-100提取的海绵；f -Chelex-100提取+乙醇沉淀提取的海绵；g- Chelex-100提取的海绵未检出后，用乙醇沉淀后重检。

3 在案件中的应用

2004年1月至2005年7月，我们受理的DNA检案中，有22起案件的送检检材中有烟头，占受理的DNA检案的4%，烟头最少的为1枚，最多的为20枚，共计81枚，其中，受踩踏等污染较重的有10枚，水浸泡过的5枚，送检时间距案发时间的间隔长短不等，最短的5天，最长的将近一年。受理检验后，对15枚污染较重和被水浸泡过的烟头采用酚-氯仿抽提法提取DNA，经扩增和检测，有8枚能进行10个基因座等位基因分型，2枚能进行3-5个基因座等位基因分型，5枚不能进行分型。其余66枚均先采用Chelex-100提取法提取烟纸上DNA，经扩增检测，有45枚能进行10个基因座分型，13枚能进行2-6个基因座分型，8枚不能进行分型，将能部分分型和不能分型的DNA上清液用乙醇沉淀后，再扩增检测，有2枚可进行10个基因座分型，其余仍是不能分型或仅有部分其因座可分型。对这19枚不能分型和仅能进行部分分型的，再取材用酚-氯仿抽提法提取DNA再扩增检测，又有2枚能进行10个基因座分型。最终，81枚烟头中有57枚能进行10个基因分型，14枚可进行部分基因座分型，10枚不能进行分型。

4 讨论

本实验结果显示：应用3种不同的DNA提取方法均可以提取烟头上脱落细胞的DNA，但效果不尽相同，用酚-氯仿抽提法效果最好，能有效去烟头中的抑制因素，并可获得高纯度的DNA。Chelex-100提取+乙醇沉淀法效果次之，此法可提高DNA的浓度，并可去除可溶于乙醇的PCR抑制物。单纯用Chelex-100提取烟纸上DNA效果尚可，但单纯用Chelex-100提取海绵上的DNA效果较差，其原因（1）海绵上比外层烟纸吸附了更多的烟叶燃烧后所产生的物质，这些物质中存在PCR抑制物。（2）海绵比较蓬松，塞在EP管底，在处理过程中管内液体不能充分震荡混匀，特别是在98℃裂解后，影响DNA的释放。在案件中，烟头的条件不尽相同，应视具体情况选用不同的方法进行DNA的提取，对于污染比较重的烟头，应采用酚氯仿抽提法，为取得更好的抽提效果，可减少消化混合液的用量，总体积用250μl（220μlTNE+10%SDS 25μl+10mg/ml PK 3μl），并在500μl EP管中进行，在DNA沉淀时，盐溶液改用1/25体积的5M NaCl^[3]，而不用3M NaAc。对于比较干净的烟头可采用Chelex-100提取法，但在此方法中，所加5% Chelex-100悬浮液的量要适中，以100μl左右为宜，所取检材应尽量剪碎。如用此方法提取的DNA无法进行PCR分型时，可在不浪费检材的情况下先采用加乙醇沉淀方法进行重检。

本实验结果还显示：烟头嘴接触端的烟纸和海绵都含有吸用者的脱落细胞，均可以进行DNA检验，为了减少PCR扩增抑制物，取材时取烟纸即可，尽量不取海绵，考虑到吸烟者的姿势和习惯，烟头烟纸上粘附的脱落细胞并不均匀，接触上下唇的两侧含量多，另两侧含量可能很少，因而取材应取半圈为宜。

本组研究对实验样本的STR分型成功率非常高，提示现场遗留的烟头是很好的DNA检验鉴定检材。但在实际案件的检验中，烟头上DNA检出率远低于实验样本的检出率，其主要原因一是案件中的烟头受污染的较多；二是提取后未能及时送检，保存时间长，保存不善造成检出率低^[4]。因而，对于现场提取的烟头应在晾干后尽早送检，对不能及时送检的，应在晾干后在干燥低温环境中保存。

【参考文献】

[1] 陈向红，刘超，李越荧光标记STR分型进行烟蒂的个人识别[J].中国法医学杂志，2002，17（5）：301

[2] 郭景元，李伯龄 .中国刑事科学技术大全.法医物证学 [M].第一版.北京：中国人民公安大学出版社，2002.192-197.

[3] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆学实验指南[M].第二版.1996.959

[4] 张庆霞，刘雅诚，唐晖，等.烟蒂DNA分型的研究[J].中国法医学杂志，2003，18（1）：29

【项目资助】广西壮族自治区科学研究与技术开发计划项目资助课题（桂科攻0015051）

【作者简介】李发贵（1969.7—），男，福建龙岩市人，广西壮族自治区公安厅副主任法医师，主要从事法医学检验鉴定和科学研究工作，邮编530012，电话0771-2892353。