增加PCR的循环次数出现异常结果1例

张晓红1，何志豪1，唐建新1

（1.广东省广州市公安局番禺区分局，广东  广州511400）

 

随着DNA检验技术的日益成熟，微量生物检材的DNA检验在许多刑事案件中发挥了重要的作用。一般常用增加PCR的循环次数来提高微量生物检材的检出率，这个方法现被国内外许多实验室广泛使用，然而这种方法容易出现误判。笔者遇到1例增加PCR的循环次数出现异常结果，为引起重视，现报道如下：

1  案例资料

2006年4月24日，死者梁某被杀，在案发现场附近找到小刀1把。后于4月26日抓获两名

犯罪嫌疑人，经两名犯罪嫌疑人分别辨认，该小刀正是作案工具。取小刀进行DNA检验并与死者的基因型比对。

2  方法与结果   

2.1方法

2.2.1模板的提取  小刀肉眼看不到有明显的血迹，联苯胺试验阳性，用两次纱线转移法擦拭小刀两面刀刃，采用chelex-100快速法提取DNA[1]。取上清备用。

2.2.2扩增及检测  扩增按Amp.FL.STR.Profiler IdentifilerTM试剂盒（ABI公司 美国）的操作手册步骤进行，其中分别扩增28及34个循环次数；产物用ABI 310型基因分析仪（ABI公司 美国）进行检测。

2.2.3结果  扩增28个循环的效果不佳（见图1）；扩增34个循环得到较好的分型(见图2)，与死者的基因型比较（见表1）：16个基因座检出15个，其中12个基因座一致，3个基因座不完全一致。提取、扩增、电泳三个步骤的阴性对照未检出基因型。

表1  死者的血样与现场小刀的基因型一览表

 

D8S1179

D21S11

D7S820

CSF1PO

D3S1358

TH01

D13S317

D16S539

死者

12,15

29,30

11,11

10,13

16,17

9,9

10,11

9,13

小刀

12,15

29,30

11,11

10,12

16,17

9,9

11,11

9,13

 

D2S1338

D19S433

vWA

TPOX

D18S51

AMEL

D5S818

FGA

死者

17,24

14,14.2

14,17

8,8

16,19

X,Y

12,13

23,24

小刀

－,－

14,14.2

14,17

8,8

14,16

X,Y

12,13

23,24

3        讨论

本案例的结果在一般的情况下可以得出排除结论，但结合案情，并考虑到检验时增加了PCR

的循环次数至34次，笔者认为不宜作出排除的结论。如果犯罪嫌疑人对作案工具的辨认正确，那就要考虑是否检验过程出现问题。由于检验的三个步骤所加的阴性对照未检出基因型，小刀

 

图1  28次循环的分型图谱                         图2  34次循环的分型图谱

检出的基因型与本实验室人员及近期处理的检材的基因型均不相符，故可排除外源DNA污染的可能。本案的小刀上血迹在增加循环次数后虽然得到了的较好的分型，但却是异常的结果，分析是因为检材模板非常微量，PCR扩增容易发生随机效应，在PCR中的前几个循环会对姊妹染色体上DNA分子的一个等位基因随机选择进行扩增，随机扩增的分子在以后会被优先扩增，对杂合子样品的检验结果会造成明显不对称扩增、甚至等位基因丢失等情况[2]；增加循环次数后，上述问题会更明显。

综上所述，笔者认为在增加PCR的循环次数的检验过程中要注意以下问题：①防止外源DNA污染。必须严格遵守公安部发布的《法庭科学DNA实验室检验规范》有关规定，做好防污染措施，如穿戴实验室专用的工作服、工作鞋、一次性手套、面罩；设备、塑料用品及操作台的定期消毒；②设置阴性对照。从检材的提取、扩增及电泳，每一个步骤都要设置一个阴性对照，以确定

是否存在污染；③有条件的对模板进行定量后在决定扩增的参数；④认真分析图谱，考虑有无非特异性扩增；⑤所得结果要先与本实验室人员比对甚至与现场勘查人员、本实验室近期处理过的检材比对，排除污染；⑥有条件的尽量重复检验，以提高结果的正确性；⑦将数据输入DNA数据库时，应该注明增加的循环次数。

 [参  考  文  献]

[1]陈松，胡兰.低拷贝模板STR分型及其存在的问题[J].中国法医学杂志，2003，18（5）：315-316.

[2] Walsh Ps,Metzgar DA,Higuchi R. Chelex100 as a medium for simple exrtaction of DNA for PCR-based typing from forensic material .Biotechniques,1991,10(4):506-509

【作者简介】张晓红（1973-），女，广东潮阳人，主检法医师，医学学士，主要从事法医DNA检案工作。

联系电话：手机13602280508 座机020-34738727

Email：pyxjzxh@163.com

通讯地址：广东省广州市番禺区市桥禺山大道13号番禺区公安分局刑警大队

邮政编码：511400