法医DNA实验室实验操作规范中的几个主要问题

童大跃，伍新尧，陆惠玲，李建金，陈丽娴

（中山大学法医鉴定中心，广东 广州 510080）

摘要 目的 探讨法医DNA实验室实验操作规范中的几个主要问题。方法 应用powerplus 16 system和identifier试剂合在不同的电泳环境温度、扩增试剂用量，模板用量等对亲子鉴定结果影响。结果 电泳环境温度、试剂用量，模板用量等对亲子鉴定结果影响如不按照操作规程，结果会出现较大变异。结论 法医DNA实验操作必须遵循操作规程，充分注意易于忽视的“小”问题。

关键词 亲子鉴定；个体识别；GeneMapperID

目前，应用于亲子鉴定和个体识别的仪器主要是ABI及BECKMAN等公司。主要用凝胶电泳和毛细管电泳为原理分离PCR扩增产物。分析用软件有genescan与genotyper,genemapperID等。用于亲权鉴定和个体认定的商品化试剂盒多种多样，可检测的STR位点数也不尽相同。大多数实验室使用的是promega公司powerplus 16 system（4色荧光）和ABI公司的identifiler（5色荧光）试剂合。本鉴定中心在使用这两种16位点的STR分型试剂盒的实验过程中，遇到一些问题，现将相关的一些报道如下。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂:

1.5%的Chelex-100液 (BIO-RAD)； Powerplus16system (Promega Biotech Co.Ltd)； Identifiler （ABI Co.Ltd）；Pop4电泳胶 （ABI Co.Ltd）；甲酰胺（ABI Co.Ltd）； Glod Taq polymorase； 3100遗传分析仪 （ABI Co.Ltd）； MWG Biotech PCR 仪(Eppendorffer)； PTC-100 PCR仪(MJ)。

1.2方法

1.2.1 DNA的提取 用5%Chelex-100法,特殊检材除外^[1]；

1.2.2 PCR扩增及电泳分离 扩增按Powerplus 16 system 使用说明进行。电泳分离：取1.0μL PCR产物加10μL甲酰胺和内标混合物变性8min, 10μL变性产物加于96孔板电泳，每16道同时电泳一个Ladder。

2结果与讨论

2.1温度对电泳的影响

电泳对环境温度要求较恒定为好，如3100遗传分析仪，一般工作环境温度要求20－30℃。环境温度的波动过大，常常引起电泳结果异常。环境温度过低，产物电泳带跑偏，导致结果无法分析，或全部结果出现OL。实验中，在其它条件不变的情况下，当电泳室内温度从15℃升高至25℃，两次电泳结果会完全不同。如图1：同一扩增产物上图是温度在10－15℃左右电泳分析结果，下图是温度升至要求范围电泳分析结果。上图分析结果全是OL，下图才出现基因型结果。

环境温度对实验结果的影响是我们经过实验验证的。南方地区如广州环境温度一般比较高，往往易于忽视温度的影响。但是，在冬天当有寒流影响时，室内温度会低于20℃，如不及时开空调，电泳时室内温度未达到20℃以上，电泳后分析结果就会如图1的异常。这一问题出现了几次，引起我们注意。所以在进行电泳之前，必须注意室内温度，只有当室内温度升至合适的温度范围内，进行电泳就不会出现这种问题。原因可能是环境温度过低，16道毛细管在加热区受热不均匀，板中心区和周边区产生温度差异，电泳时，其电泳迁移率不同，导致结果异常。

图1：同一扩增产物在不同的电泳环境温度下电泳结果

上图是温度在 15℃左右电泳的结果，下图是温度在25℃时电泳结果

2.2样本变性后放置时间的影响

PCR产物经变性后应及时电泳。当遇到特殊情况，如工作特别忙等，变性完后无法及时电泳，应将变性后的产物放－20℃冰箱且时间不宜过久，实验发现在5小时内电泳，峰值不会明显改变。放置过久，如过夜后，峰值会明显降低，影响结果的判读，所以变性后最好不要过夜。

2.3模板浓度影响

PCR扩增对模板DNA浓度要求不是十分高，在一定范围内对结果不会发生很大影响。但是，模板浓度超出这个范围，会出现明显的优势扩增现象，或者出现很多杂带；当模板浓度超出这个范围，样品干扰物增加，扩增效果差；模板浓度超出这个范围，扩增产物量少，峰值过低，杂带增加。图2:本实验室用1/2量试剂，模板用量分别为0.08和1.2ngDNA扩增效果图。

图2:用1/2量试剂分别用0.08和1.2ngDNA扩增效果图

2.4 试剂的效能检验

目前，国内大多司法鉴定机构是要进行成本核算。在使用这些试剂合时,大多实验室对试剂用量未按使用说明书要求的用量进行实验，而是进行了减量。到底如何减量，比例和用量多少合适？目前各实验室各行其事。有用半量，甚至有用1/4量的。本实验室用3100遗传分析仪，genemapperID 3.1v分析软件进行试验，对于不同浓度的同一模板含DNA分别1.2ng，0.5ng, 0.08ng。用不同量试剂包括全量、3/4、1/2、1/4量进行扩增。发现用0.08ngDNA，用1/4量试剂，有基因的丢失，且优势扩增明显。所以每一个实验室在进行试剂调整，一定要进行效能试验。图2结果能部分说明试剂的效能影响。

2.5 正确发挥Ladder的作用

当应用3100遗传分析仪进行电泳分离产物时，每次电泳（16道）应同时跑一个ladder。如用377DNA测序仪（37道）分离产物，最好同时跑两个Ladder,这样结果比较可靠。因为电泳边缘效应易使电泳产物中间和两边走偏，以免分型结果有误。另外，很多因素影响ladder的电泳效果，如前述温度、buffer浓度、胶的放置时间等均影响电泳迁移率。不同天间、不同批间电泳，ladder迁移位置、分离度会不同。借用ladder存在相当大的风险, 一般不要借用Ladder。而且，每次电泳完分析结果后，应对 Ladder的值与操作说明书上的结果比对，看看是否有偏离，条带丢失和值是否正确等。否则，分析出来的结果会出现错误。

以上几点是我实验室进行亲子鉴定过程出现和遇见的问题。当然，还有些问题也是值得注意的：如缓冲液的更换，胶的使用时间，换胶和清洗后的毛细管定位和毛细管的使用次数等。其实，DNA亲子鉴定技术在理论和应用中还有许多问题和陷阱^[2]，我们必须十分谨慎。在进行亲子鉴定和个体识别时，实验操作必须小心并严格按规程进行，克服人为因素，避免因实验操作造成的误差。只有这样才能保证结果的真实和可靠。

【参考文献】

[1] 李莉，柳燕，李成涛，等.亲权鉴定实验室规范及技术标准建议[J].中国司法鉴定，2006，02：28－35.

[2] 伍新尧.高级法医学[M].第一版.郑州：郑州大学出版社，2002：207－256。