检测12S rRNA 基因鉴定微量生物检材的种属

扩增12S rRNA基因鉴定生物检材种属

骆宏，陆惠玲^*，姚亚楠，吕德坚，章雅清，陈丽娴

（中山大学基础医学院法医物证学教研室，广东广州 510080）

【摘要】目的通过扩增12S rRNA基因，建立一种简明、快速、准确、能同时鉴定多种物种种属的方法。方法设计一对通用引物和分别针对人、猪、鸡和鸭等目标种属的特异引物，同时扩增各物种12S rRNA基因。以通用引物扩增片段为参照，特异引物扩增片段用于种属鉴定，分别对陈旧血痕和高温处理肌肉进行鉴定；特异引物扩增非目标种属12S rRNA基因以检测其特异性；目标种属扩增产物的测序结果与GenBank既有序列比对，以检测该法的准确性。结果通用引物扩增12S rRNA基因，各物种均有400bp左右的扩增片段；特异引物只对目标种属有扩增产物，片段大小为244bp～387bp不等；目标种属测序结果与GenBank既有序列比对，一致性达99％以上；盲测结果与实际检材完全相符。结论扩增12S rRNA基因，可同时鉴定多种物种的种属；所建立的方法操作简单、结果准确、有高度的特异性。

【关键词】法医学； 12S rRNA基因；生物检材；种属鉴定

Identify species of biological materials by amplifying 12S rRNA gene/LUO Hong, LU Hui-ling*, YAO Ya-nan, et al / Department of Forensic Biology, Preclinical Medicine School, Sun-Yat Sen University, Guangzhou 510080

【Abstract】 Object To establish a simple, quick and exact method for species identification, which can identify multi-species at the same time by amplifying 12S rRNA gene. Method Designing a pair of universal primers to amplify target gene of ten species and pairs of species-special primers which can respectively amplify target gene of human, pig, chicken and duck. Segments amplified by universal primers were used as control, segments amplified by species-special primers were used to identify target species. The specificities of primers were tested by amplifying the same gene of non-target species, the veracity of the method was tested by comparing the sequencing results with sequences existing in GenBank. Results Universal primers

amplified 12S rRNA gene of all species, the amplified segment size was about 400bp, while species-special primers only amplified the same gene of target species, the amplified segments size were between 244bp and 387bp. Comparing sequencing results with corresponding sequences in GenBank, identities were over 99%. The blind-testing results were completely correct. Conclusions Multi-species can be identified at the same time by amplifying 12S rRNA gene, the method for species identification is simple, exact and highly special.

【Keywords】Forensic science, 12S rRNA gene, Biological materials, Species identification

在日常法医工作中，常常需要对各种生物检材作出种属鉴定,以明确检材是来自人体还是某种动物，为后续个体识别提供进一步的线索。既往的一些研究都难以实现用简明的方法同时鉴定出人和非人物种的具体种属，很多方法也存在不适宜鉴定经高温处理、微量陈旧降解的特殊检材等问题^[1-5]。因此长期以来，寻求一种优良的遗传标记，建立简明、快速、准确的种属鉴定方法一直是法医学界急需解决的难题。本研究通过同时扩增多种物种的12S rRNA基因，以鉴定微量生物检材的种属，取得了较好的效果，报道如下。

1材料和方法

1.1 实验材料

室温保存1～2年的人、猪、鸡、鸭、牛、羊、鹅、兔、鼠和狗血痕；从菜市场获取猪、鸡、鸭腿部肌肉；从冰冻保存3～5天的人尸体获取胸部肌肉；将0.5g大小的上述各种肌肉置100 ⁰C水中煮沸30min。每种标本各取5例。

1.2 DNA提取

剪取5mm×5mm的血痕、0.05g高温处理肌肉，采用Chelex-100法抽提DNA^[6]。肌肉标本在加入Chelex-100时，同时加入10μg/ml的蛋白酶K6μL。

1.3引物设计

从GenBank中获取上述物种12S rRNA基因的全长序列，采用BioEdit软件进行序列分析，参照Miguel A等^[7]的方法设计引物。

表1 各引物序列及扩增片段长度

Fig1. Information of primers and length of amplified products

引物名称	引物序列（5’--3’）	用途	扩增片段长度
12SF 12SR	CCACCTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT TCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT	正向通用引物反向通用引物	394-404bp 394-404bp
12SH	TACTGCTAAATCCACCTTCGACCC	人特异引物	244bp
12SS	GTTACGACTTGTCTCTTCGTGCA	猪特异引物	387bp
12SD	CACTTACCTCATCTTTGGCATTGAC	鸭特异引物	373bp
12SC	CCGTCTTAAAGTGAGCTTAGCGG	鸡特异引物	285bp

其中，12SF与12SR组成通用引物对，用以扩增通用片段作参照；12SF与目标种属的反向特异引物组成特异引物对，用以扩增特异片段作种属鉴定。所有引物由北京赛百盛公司合成。

1.4 PCR反应

采用25μL反应体系，内含1×PCR Buffer,2mM的Mg²⁺,0.2mM dNTP, Taq DNA聚合酶1.0U, 各0.2μM的正、反向引物，3.0μL的DNA（含DNA量40～107ng）,其余为去离子双蒸水。扩增条件为：94⁰C预变性2min；94⁰C 30s、63⁰C 30s、72⁰C 45s进行35个循环，最后72⁰C延伸5min, 4⁰C保存。

1.5引物的种属特异性检测

用各特异性引物扩增非目标种属的12S rRNA基因。

1.6 PCR产物的检测与测序鉴定

扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，90V 90min后，凝胶成像仪成像检测。目标种属的扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，回收目的片段，置EP管中用100μL去离子双蒸水浸泡,4⁰C过夜。取1μL浸出液进行二次扩增，扩增产物交上海英骏生物技术有限公司进行双向测序，将测序结果用BioEdit软件分析整理后，进入GenBank用Blast软件进行序列一致性比对。

1.7盲测

由他人将人、鸡和鸭的血痕标本各一份编号后，交由实验者进行盲测，进一步验证该法的准确性和实用性。

2 结果

2.1通用引物扩增结果

通用引物扩增人、猪、鸡和鸭12S rRNA基因的结果见图1，扩增片段大小分别为：人394bp、猪404bp、鸡402bp、鸭394bp；通用引物扩增牛、羊、鹅、兔、鼠和狗等物种12S rRNA基因的片段大小为392bp～ 402bp不等（图2）。各物种5例标本扩增结果一致。

图1.通用引物扩增目标种属12S rRNA基因

M：Marker；1、3、5、7泳道依次为人、猪、鸡、鸭的血痕；2、4、6、8泳道依次为人、猪、鸡、鸭的高温处理肌肉。

Fig1. Amplified 12S rRNA gene of target species with universal primers

M：Marker；Lane 1、3、5、7 respectively represents the amplified product of blood sample of human、pig、chicken and duck; Lane 2、4、6、8 respectively represents the amplified product of muscle sample of human、pig、chicken and duck which were dealt with 100 ⁰C water for 30 min..

图2.通用引物扩增非目标种属12S rRNA基因

M：Marker；1、2、3、4、5、6泳道依次为牛、羊、鹅、兔、鼠、狗。

Fig2. Amplified 12S rRNA gene of non-target species with universal primers

M：Marker；Lane 1、2、3、4、5、6 respectively represents the amplified product of blood sample of buffalo、goat、goose、rabbit、rat and dog.

2.2特异引物扩增结果

特异引物扩增上述物种该基因的结果见图3。各目标种属的扩增片段大小分别为：人244bp、猪387bp、鸡285bp、鸭373bp；特异引物扩增非目标种属的12S rRNA基因均无扩增产物。各物种5例标本扩增结果一致。

图3. 特异引物扩增目标种属12S rRNA基因

各泳道样本排列同图1。

Fig3. Amplified 12S rRNA gene of target species with species-special primers

The annotation is same as Fig 1..

2.3测序及比对结果

目标种属的测序结果显示12S rRNA基因实际扩增片段的大小与预计一致；序列与GenBank既有序列比对，一致性分别为：人99.74％、猪100％、鸡100％、鸭99.74％。人血痕扩增产物的测序结果见图4、图5。

图4. 通用引物扩增人12S rRNA基因测序图

Fig 4. Sequencing result of human 12S rRNA gene amplified with universal primers.

图5.特异引物扩增人12S rRNA基因测序图

Fig5. Sequencing result of human 12S rRNA gene amplified with species-special primers.

2.4 盲测结果

盲测结果见图6。1号检材为鸭、2号检材为人、3号检材为鸡，与实际结果一致。

图6. 盲测结果

M：Marker；1-4泳道：1号检材；5-8泳道：2号检材；9-12泳道：3号检材。1、5、9泳道：人引物扩增产物；2、6、10泳道：鸭引物扩增产物；3、7、11泳道：鸡引物扩增产物；4、8、12泳道：猪引物扩增产物。

Fig6. The blind-testing result of blood samples.

M：Marker；Lane1-4: No.1 sample, Lane5-8: No.2 sample, Lane9-12: No.3 sample. Lane1、5、9: product amplified with 12SH primer; Lane2、6、10: product amplified with 12SD primer; Lane3、7、11: product amplified with 12SC primer. Lane4、8、12: product amplified with 12SS primer.

3 讨论

近年来，随着DNA分型技术的不断发展，先后有多种基因^[3-5]用于法医生物检材的种属鉴定。然而，对这些基因的研究发现存在以下不足：扩增28S rRNA基因，即使单一物种也会产生较多片段，不适合作混合检材种属鉴定^[8]；Cytb基因不经过测序或酶切则无法区分人和动物的具体种属^[4、9-11]，即使联合D-Loop扩增，也只能区分出人源性和动物性检材^[3]； TP53基因在不同实验室扩增同一种属所得片段大小不等，因而难以断定哪个结果正确^[5、12]；Alu序列只能将人和灵长类同其他动物区别，无法鉴定动物具体物种^[4]等等。

线粒体DNA包含了22个tRNA、2个rRNA、13个蛋白编码基因。由于有着不同于核DNA的一些特点，使线粒体DNA在种属鉴定中有以下一些优点：（1）单细胞拷贝数多，使得它比核DNA更容易扩增目的片段。（2）线粒体DNA在多数生物都是母系遗传的单倍体型，不发生重组，这种特性使得对它的研究更容易也更直接。（3）线粒体DNA比核DNA进化速度更快，即使是亲缘关系比较密切的种属也能够被鉴定和识别。12S rRNA基因是线粒体DNA的一段，大小约950-1050个碱基。相对于Cytb基因，12S rRNA 基因的进化速率与mtDNA 基因组的平均进化速率基本相同，且无平行基因传递现象，因此在核DNA中无其拷贝。陈旧检材和特殊处理检材由于核DNA多数已经降解，因此，12S rRNA 基因更适合于这些检材的鉴定。利用上述特点，本研究针对12S rRNA基因，设计以通用引物扩增片段作为参照，特异引物扩增片段用以鉴定特定物种；特异片段小于相应物种的通用片段避免了实验结果的假阴性。鉴于现场检材的特殊性，本实验从实际应用出发，对微量、陈旧、高温处理等生物检材进行检测。实验结果表明：无论是通用引物还是特异引物，对各物种的5例标本扩增结果均一致；无论是新鲜血痕、陈旧血痕还是高温处理肌肉，扩增结果也一致。这些均说明本方法稳定可靠、检材适用范围广泛。特异引物对目标种属分别扩增出244bp～387bp的特异扩增片段、而对非目标种属无扩增产物，说明本方法用于种属鉴定有较好的特异性；各目标种属扩增产物的序列与GenBank中既有序列比对显示出的高度一致性，说明本法用于种属鉴定具有高度的准确性；盲测结果进一步验证了本法的准确性和实用性。

正确的引物设计对于在同一反应条件下同时鉴定多种物种具有关键性的作用。本研究中设计的引物力求符合以下要求：通用引物能够扩增人、哺乳动物、禽类等物种的12S rRNA基因的通用片段；特异引物只对目标种属有扩增产物，而对非目标种属无扩增产物；通用引物和特异引物的PCR反应条件一致，引物之间能够组合以提高效率。本研究通过对符合要求的引物进行多次筛选甄别，提高了引物的特异性，也进一步保证了本方法的准确性。

相对于测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、RAPD等技术而言，本实验通过检测12S rRNA基因建立了一种简明、快速、准确、特异性好、实用性强的生物检材种属鉴定方法，便于在基层推广，用于法医学日常检案工作。由于扩增条件一致，可望进行不同组合的复合扩增，达到同步鉴定多物种具体种属的目的，提高工作效率。

附录：参考文献

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附图

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