荧光标记三个miniSTR基因座复合扩增系统的建立
王会品1,2 ， 刘超2
（1.中山大学法医学系，广东 广州 510080；2.广州市刑事科学技术研究所，广东 510030）
[摘要] 目的 建立扩增片段<135bp,包括D5S818, D8S1179, D16S539三个miniSTR 基因座复合扩增系统。方法 采用不同荧光染料标记引物，通过PCR扩增，利用ABI3100遗传分析仪进行片段长度分析，对100份无关个体血样，10个家系样本以及30份高度降解检材进行检测。结果 本系统DNA分型结果与AmpFLSTR® Identifiler® 试剂盒完全一致，且灵敏度高于AmpFLSTR® Identifiler® 试剂盒。
结论 本系统可以应用于个人识别和亲权鉴定，为降解DNA样本分型提供了新的方法。
[关键词]miniSTR；复合扩增； D5S818, D8S1179,
D16S539
The establishment of three loci of miniSTR multiplex set by fluorescence
labeled primers
Wang Hui-pin1,2,
Liu Chao2
(1. Department of
Forensic Biology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080,China;
Guangzhou Criminal Science ﹠ Technology Institute, Guangdong 510030,China)
[Abstract]
Objective To establish a miniSTR multiplex set
which includes STR markers as D5S818, D8S1179, D16S539, whose amplified fragments shorter than 135bp. Methods
After amplified with fluorescence labeled primers , ABI3100 Genetic Analyzer
was used to analyze the length of fragments, sample from 100 unrelated
individuals ，10 genealogies and 30 highly degraded specimens were
genotyped. Results The genotypes resulted from miniSTR are consisted with
AmpFLSTR® Identifiler® kit, as well as a high sensitivity. Conclusion
The multiplex set is useful in personal identification and paternity test,
especially in the degraded DNA sample.
[Key words] MiniSTR ； multiplex PCR; D5S818, D8S1179, D16S539
STR（short
tandem repeat）已经广泛用于法医学个人识别和亲权鉴定，但是，在法医学应用实践中，许多微量及降解的检材，STR技术不能成功地得到
明确分型结果，表现为“优势扩增”或者“无效扩增”，甚至无扩增产物[1]。近年来有作者采用miniSTR技术，通过缩短STR扩增片段的长度提高检测灵敏度和降解片段的检出率，获得较好的结果
[2,3]。
miniSTR的引物位置决定PCR产物的大小，但是与原来STR基因座相比，核心序列的重复次数却没有改变，这就有利于miniSTR进行基因分型，并且可以与目前使用的商品化试剂盒的STR基因分型进行比较[4]。
本研究建立了一套包含D5S818，D8S1179和 D16S539的miniSTR复合扩增系统，并对其分型准确性进行了研究，现报道如下。
1
材料与方法
1.1 样本
100份无关个体血样（广州市公安局刑事科学技术研究所日常检案中随机选取），10个家系样本（中山大学法医鉴定中心日常检案积累），均用Chelex-100法提取模板DNA。
30份腐败组织样本取自广州市公安局刑事科学技术研究所日常检案中，涉及的死亡时间为半个月到一年高度腐败尸体的软骨、指甲，均用Chelex-100有机法提取模板DNA。
1.2 引物
引物序列通过查阅文献获得[5,6]，并委托上海生工合成，其中D5S818一条引物5′端标记HEX荧光，D8S1179一条引物5′端标记TARMA荧光, D16S539一条引物5′端标记5-FAM荧光。
1.3 复合PCR扩增反应
PCR扩增体系25μl, 其中 10×buffer PCR缓冲液2.5μl，MgCl2溶液1.8μl， dNTPs2.5μl（浓度为2mmol•L-1），D16S539的引物0.5μl，D5S818的引物0.6μl，D8S1179的引物0.8μl（以上引物浓度均为10μmol•L-1）,AmpliTaq
Gold® DNA polymerase0.1μl（美国ABI公司），加入模板DNA为2μl。
热循环反应参数如下：
1.4等位基因阶梯的制备
以AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒（美国ABI公司）的allelic ladder为模板，以1：1000倍稀释，按照前述复合扩增条件进行扩增备用。
1.5 不同浓度Control DNA 9947 的制备
将AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒（美国ABI公司）的Control DNA 9947（浓度：100pg/μl）加入不同体积的双蒸水，使Control DNA 9947的浓度分别为25 pg/μl和33 pg/μl。
1.6 扩增产物的检测
扩增产物1μl、甲酰胺9μl和内标ILS600 1μl (美国Promega公司)混合变性后，应用ABI3100全自动遗传分析仪（美国ABI公司）进行自动检测，电泳参数为：运行温度
2 结果
2.1
minisSTR扩增片段与AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒的比较
本复合扩增系统包含的D5S818, D8S1179和 D16S539三个常染色体STR基因座的扩增片段均小于135bp,与AmpFLSTR® Identifiler® 试剂盒的等位基因片段相比较，扩增片段都明显缩短。
2.2
miniSTR复合扩增系统的分型准确性
利用miniSTR复合扩增系统对100份无关个体血样，10个家系样本进行检测，经与 AmpFLSTR® Identifiler®试剂盒（ABI公司）的基因分型结果比较，发现两者完全一致。
2.3 灵敏度检验
对不同浓度Control DNA 9947进行扩增时，结果显示在DNA含量为100pg时，Identifiler®试剂盒还可以进行正确的分型，但扩增产物产量比较低；在DNA含量为67pg时，部分基因座还发生了等位基因缺失；在DNA含量为50pg时，分型结果已经无法识别（图1）。而应用miniSTR复合扩增系统对50pg的DNA还可以进行分型，虽然扩增的特异度有所下降，但对分型结果的正确性没有干扰。
图1 miniSTR复合扩增系统与AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒检测结果的比较
Figure 1 The comparisons of genotypes resulted
from miniSTR multiplex system and AmpFLSTR® Identifiler® kit
3 讨 论
STR遗传标记已经成为法医DNA分型的一个非常有价值的工具
，运用PCR技术对STR基因座进行复合扩增可以得到微量DNA样品的基因分型。但是法医检案工作中，很多情况下DNA样品已经高度降解 [7]。由于miniSTR扩增片断更小，从而明显提高了降解DNA样品分型的成功率。Chung等[8]对miniSTR基因座进行研究发现其灵敏度达到31pg/25μL,远高于商品化试剂盒，可见，该技术还适用于微量检材的检测。
本系统包括了D5S818, D8S1179和 D16S539三个常染色体STR基因座,应用新设计的引物，STR等位基因片断长度更短(<135bp)，该系统性能稳定，重复性好，扩增结果可靠，可以用于亲权鉴定和个人识别。用AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒的ladder为模板进行扩增，得到miniSTR的ladder，各基因座等位基因均得到很好的扩增。所检测的160多份样本，包括高度降解的检材，提取DNA后均能正确分型。扩增片段产物相对荧光强度（Rfu）均在600以上，扩增峰值均衡，无“优势扩增”或“漏扩”等现象。miniSTR技术不仅可以应用于降解检材，还可以提高扩增的灵敏度，对于微量的DNA也可以进行正确的分型。
由于STR等位基因片断长度的减小，各基因座的等位基因片段长度范围的重叠更多了，用现有的五色荧光技术，要同步扩增出足够的基因座，必然加大了复合扩增的难度。要达到与商品化试剂盒16个STR基因座相同的个人识别力，就需要3～4个miniSTR复合扩增系统[5]。目前大多数研究所用的miniSTR基因座通常选用与商品化试剂盒相同的STR基因座，这样选择基因座所建的miniSTR系统优势是明显的，表现在分型数据具有兼容性。在法医现场工作中收集的降解DNA样品，用miniSTR复合扩增系统的进行DNA分型，分型结果可以输入DNA数据库，与数据库中已有的数据具有可比性，从而可以认定罪犯，在法医检案中发挥更大的作用。
总之，miniSTR作为STR检验的一个新的发展方向，可以更好地解决法医学实践中遇到的降解检材的DNA分型难题，更好地为法庭科学服务。
参考文献
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图1 miniSTR复合扩增系统与AmpFLSTR®
Identifiler® 试剂盒检测结果的比较
Figure 1 The comparisons of genotypes
resulted from miniSTR multiplex system and AmpFLSTR® Identifiler® kit