不同载体上的脱落细胞DNA提取

李红霞¹ 陈晓晖¹王会品²

（1.广州市刑事科学技术研究所，广东广州，510030；

2. 中山大学法医学系，广东 广州 510080）

【摘要】 结合日常检案的经验，探讨不同载体上所附着的少量脱落细胞的DNA提取方法。

【关键词】载体 脱落细胞 磁珠

随着DNA检验技术的发展及其在办案中发挥的巨大作用，办案单位对该项技术的依赖性愈来愈强，检验人员对物证的检出率有了更高的要求。常规生物物证的提取(如精斑、血痕、组织等)，目前技术方法基本上已经规范，且检出率高，而微量物证(如口杯、吸管、牙刷、手套、衣领、电线、果核、香口胶等载体上所遗留的脱落细胞)的检验，目前也愈来愈受到重视。作者结合本实验室这类检材的检验经验，对这类检材的DNA提取作了初步的探讨。

1 材料

样品均为本实验室刑事案件的物证检材，瓶（杯）口或吸管、牙刷、手套、袜子、围巾、帽子、口罩、衣服、电线、绳子、香口胶、眼镜、吃过的果核等15种样品。

2方法

2.1瓶（杯）口或吸管上脱落细胞的提取^[1，2]

用去离子水湿润棉签或取3-5cm棉纱，在瓶（杯）口部位或吸管上接口部位小心的反复擦拭，把已擦拭的部分小心剪下放入0.5mL的离心管中，擦拭的棉纱直接放入离心管中，有瓶盖的水瓶，用同样的方法在瓶盖上提取。加5%chelex-100液25-100μL（视提取的检材量加），56⁰ C保温30min，高速震荡10s,98℃变性8-10min，高速震荡10s，离心3min（12000r/min），上清2μL用Identifiler试剂盒扩增，扩增产物用ABI3100型遗传分析仪检测。

2.2牙刷上的脱落细胞的提取

2.2.1 cheLex-100提取 牙刷用10mL的纯净水浸泡洗涤半个小时以上，其间不断振荡，洗涤牙刷，然后取出牙刷，洗涤液离心，沉淀物转移到0.5mL的离心管，加5%cheLex-100液100-200μL，PK3-5μL，快速提取DNA 。

2.2.2磁珠法 牙刷洗涤后的沉渣加入配置的裂解液 (100μL裂解缓冲液加1μL 1M DTT)100μL，95⁰ C裂解30min。然后每管加7μL的磁性树脂，旋涡震荡后，室温放置5min，置磁力架吸取液体。 再加100μL配置的裂解液洗涤一次，配置的洗涤液（2x洗涤缓冲液：无水乙醇：乙丙醇）洗涤三次，放置在磁力架上室温静置10-15min，加25-50μL的洗脱液， 65⁰C溶解15min，置磁力架，上清转移另一管中，用于扩增。

2.3 手套、袜子、围巾、口罩、衣服脱落细胞的提取

2.3.1 cheLex-100提取 小心剪取和人体易摩擦部位（如手套的大拇指缝、指尖、掌部等，袜子的足跟、脚面、脚趾部位，口罩上剪取耳部和口唇部位，上衣的衣领或腋下部位，裤子的裤腰部位）的纤维到1.5mL的管中，用纯净水浸泡洗涤半个小时左右，其间不断振荡，套管离心，沉淀物用来提取DNA。cheLex-100提取同2.2.1。

2.3.2磁珠法 剪取的纤维直接加配置的裂解液（裂解液量视检材的量加，以淹没检材为准），95⁰ C裂解30min后套管离心，收集的液体加7μL的磁性树脂，旋涡震荡后，室温放置5min，置磁力架吸取液体，其余方法同2.2.2。

2.4 电线或绳子上脱落细胞的提取

用湿润的棉签小心擦拭和人体接触端如勒颈、捆手的部位，如电线或绳子脏时，用无水乙醇冲洗两次，晾干后再提取。可用cheLex-100法或磁珠法提取DNA。（这类载体的DNA提取建议使用棉签，因棉纱太短、量少，在提取的过程中不能很好完整的擦拭接触面）

2.5香口胶上脱落细胞的提取

挑取香口胶的中间部分约芝麻大小量放入0.5μL的离心管中，加5%cheLex-100液200μL快速提取DNA。

2.6眼镜上脱落细胞的提取

用3-4cm长的棉纱，用纯水打湿后，小心的在眼睛托或夹鼻处擦拭，用cheLex-100法快速提取。。

2.7吃过的果核上的脱落细胞的提取

棉线打湿后小心的沿着水果上的咬痕擦拭，果核则在果核上擦拭，可用磁珠法提取。

3结果

本实验室所检验的矿泉水瓶及水杯26例，有6例未检出，未检出的表现在瓶、杯口处残存的水多；吸管检验8份，全部检出；手套检验8只，有4只未检出，表现在一对手套表面极脏，一对干净，似未曾使用过；上衣检验过5件，均为贴身穿着，均在衣领部位取检，均检出，但出现峰值不平等现象；裤子检验过2件，1件检出，1检未检出，峰值也出现不平等；电线和绳检验4份，电线和绳子均检出1根；吃过的话梅核共检验6梅，2枚检出，有2枚塑料袋内提取，已发霉；香口胶检验10份，全部检出；鞋子检验3只，1只检出，2只是在水田中发现，未检出；面包检验2份，均未检出。

4案例

案例1 2003年12月17日晚，某女被多名男青年挟持到广州某大厦酒店，胁迫女事主说出银行密码并取走银行卡内存款。侦查得知案犯曾在此酒店居住过，从酒店房间提取了一次性牙刷两把，要求通过DNA鉴定是否被案犯用过。本文作者用cheLex-100法提取DNA。检验结果见图1

案例2 2005年9月31日，在广州某区一个废旧的小庭院内的植物丛中发现一具用凉席包裹的尸体，尸体高度腐败，法医现场勘察时，在案发现场的一阁楼内暗阁中发现一白色线手套，手套上没有任何血痕、唾液等斑迹遗留，但嫌疑人交代曾用此手套捂过死者的嘴。作者用cheLex-100法和磁珠法两种方法检验的结果见图2。

案例3 2005年3月1日，在某区城郊镇某中心小学发生一起教学电脑盗窃案，现场提取到沾满泥土的苹果皮两片，要求和嫌疑人比对。作者用棉线沾取无菌去离子水擦拭皮表面，一片苹果皮上转移的棉线用cheLex-100法提取未检见结果，另一片苹果皮上转移的棉线用磁珠法直接提取，检出11个STR基因座，与嫌疑人基因型比对，分型结果完全相同。检验结果见图3。

5讨论

日常生活中，人体与物体接触后均会遗留少量的组织细胞，这类细胞如果能够进行STR分型，将对打击犯罪起着重大的作用。但由于所接触的物品不同及个人的生活习惯的差异，这类物体上所含的脱落细胞的量也不尽相同，所以在提取时要区别对待。

日常生活习惯中，牙刷虽经过清洗，但所残留的脱落细胞部分可被水冲去，但是附着物完全去除的可能性还是比较小，通过对牙刷进行再次浸泡洗刷，并沉淀，还是可以得到相当数量的脱落细胞。瓶（杯）口或吸管上脱落细胞因和口唇的密切接触，会遗留很多口腔脱落细胞，瓶（杯）口因有水的反复冲洗，残存的细胞会少于吸管。手套、袜子、围巾上因接触的面积大，范围广，不能进行固定部位的提取，要依物证表面情况选择摩擦痕迹重的部位进行提取。衣领上因与颈部的密切摩擦，所含人体的油脂较多，用chelex-100法往往出现峰值不平等，建议多用磁珠法。绑手或勒颈的电线、绳子(未造成受害者出血)上，因接触的面积小，范围广，所沾附的脱落细胞有限，提取液的量一定要少，脏的绳子建议用磁珠法，扩增的峰值会偏低，要依比对物证确定基因型。咀嚼后的香口胶因在口腔里反复咀嚼，所以含有大量的口腔上皮细胞，扩增结果谱带清晰，峰值高。咬过的水果、吃过的果核因受果胶、果酸的影响，建议直接用磁珠法提取，同时由于这类检材所附者的脱落细胞一般较少，在提取过程中，所用的棉签不可来整支来回旋转，要在一侧的棉签面上擦拭，所用的棉线也要尽量少。降解严重的、极微量的，建议用25μL全体系扩增，扩增时适当的增加2-4个循环，循环数不要超过32个，否则会出现非特异性扩增或漏扩增，影响结果判定。

对微量DNA进行分析，由于所含的DNA量少，且很多时候受所附着载体的介质影响，结果产生不对称扩增、等位基因丢失或增加等问题，甚至被污染，所以要结合比对对象，确定结果是否可采用，无比对象检材要进行重复试验，基因型相同时才可确定^[3]。

【参考文献】

[1]尚宝良，平原，.瓶杯口微量生物物证的DNA分型[J] 法医学杂志.2004,20,4:233

[2]杨电，胡慧英，肖建勇，等.用拭子提取脱落细胞进行DNA检验[J] 中国法医学杂志.2004，19，增刊:24

[3]陈松，李万岁，胡兰，等 微量生物检材：容易忽略的生物物证 第二届全国法医DNA检验技术交流会

图1 Chelex-100法所做的两把牙刷的基因座图谱

图 2 两种方法所做的手套基因座图谱

图3 磁珠法所做的果核基因座图谱

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