HPLC法检测人外周血5-^mC含量及其与年龄相关性研究

尹慧，黄代新，翟仙敦，杨庆恩

（华中科技大学同济医学院法医学系，湖北 武汉 430030）

[摘 要] 目的 探讨人外周血中5-^mC含量的随龄变化规律。方法 将94例健康个体（4岁～87岁，其中男性50例，女性44例）按年龄分为6组：＜20岁、20岁～30岁、30岁～40岁、40岁～50岁、50岁～60岁及＞60岁组，用HPLC法对其外周血中的5种脱氧核苷进行定量分析。结果 50岁～60岁组（平均年龄54.7岁）和＞60岁组（平均年龄71.7岁）间的5-^mC含量差异无显著性，但与其它四组有明显差异（P＜0.0001）；＜20岁、20岁～30岁、30岁～40岁和40岁～50岁四组间的差异无显著性。男性5-^mC含量的均值（3.5%±0.005%）稍低于女性（3.32%±0.006%），但差异无统计学意义。结论 5-^mC的含量随年龄的增长呈下降趋势。虽然下降程度很小，但在年龄推断中有一定参考价值。

[关键词] 5-甲基脱氧胞苷；HPLC；年龄；法医学

Age Related Changes in 5-methylcytosine Content in Human Peripheral Leukocytes by HPLC/YIN Hui, HUANG Dai-xin, ZHAI Xian-dun, YANG Qing-en /(Faculty of Forensic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

[Abstract] Objective To investigate age-dependent variation of 5-methylcytosine (5-^mC) content in human peripheral leukocytes. Methods 94 healthy individuals (50 males and 44females) of age varying from 4 to 87 years were dividied into six groups by age: under 20 years, 20 to 30 years, 30 to 40 years, 40 to 50 years, 50 to 60 years and beyond 60 years. Their 5-^mC content in human peripheral leukocytes were analyzed by HPLC. Results The 5-^mC content of age between 50 to 60 years (mean age 54.7) and beyond 60 years (mean age 71.7) are statistically not significant., but statistically highly significant (P＜0.0001＝ in comparison to the other four groups; The other four groups are statistically not significant. Males showed a subtle but statistically not significant higher mean 5-^mC content than females. Conclusion 5-^mC content in human peripheral leukocytes decreases with age. Although the age-dependent decrease of 5-^mC content was relatively small, it may be helpful in age estimation.

[Key words] 5-methylcytosine; HPLC; Age; Forensic medicine

DNA甲基化是储存表遗传学（epigenetics）信息的主要形式，在哺乳动物体内，被修饰的碱基主要是5′-CpG-3′二核苷酸中的胞嘧啶。与反映个体遗传变异的传统标记不同，甲基化标记代表组织细胞的发育分化特征（基因表达差异），揭示另一层次的基因组多样性^[1]。DNA甲基化为正常发育所必需。正常细胞中DNA甲基化的功能包括转座因子的沉默、病毒序列的失活、染色体完整性的维持、X染色体失活、基因组印记及大量基因的转录调节等^[2]。一些研究还发现随着个体年龄的不同，DNA甲基化水平存在差异，提示个体的发育和衰老过程与DNA甲基化相关^[3,4,5]。本文用HPLC法检测94例健康个体外周血中的5-^mC含量，探讨其随龄变化规律。

1．材料与方法

1.1 试剂和仪器

Waters 510高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，柱温箱，HW-2000色谱工作站。

5种脱氧核苷标准品（2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧胞苷、2′-脱氧腺苷、5-甲基-2′-脱氧胞苷）和核酸酶P1购自美国Sigma公司；核酸酶A、核酸酶T1和牛小肠碱性磷酸酶购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.2 样本及分组

94份（4岁～87岁，其中男性50例，女性44例）汉族无关健康个体EDTA抗凝静脉血，由广州军区武汉总医院血库提供。按年龄分为6组：＜20岁、20岁～30岁、30岁～40岁、40岁～50岁、50岁～60岁及＞60岁组。

1.3 DNA提取及处理

每份检材取1ml，常规酚/氯仿法提取DNA。将提取的DNA溶于200ml双蒸水中，加核酸酶A至终浓度为100mg/ml，核酸酶T1至终浓度为2000U/ml，混匀后于37℃水浴3h。孵育后加等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）萃取一次，无水乙醇沉淀后溶于20ml双蒸水。紫外分光光度法定量。

DNA的水解^[6]：反应体系100ml，内含20ml DNA，40ml 30mmol/L NaAC，4.5ml 20mmol/L ZnSO₄，9ml 10×buffer（牛小肠碱性磷酸酶），6ml核酸酶P1（1mg/ml），4ml牛小肠碱性磷酸酶，16.5ml双蒸水。37℃孵育9h，然后85℃ 15min终止反应。－20℃保存备用。

1.4 HPLC分析

根据五种脱氧核苷的性质，优化分离效果得最佳的色谱条件：色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，10mm）；流动相：0.1％（V/V）磷酸；流速：1.5ml/min；检测器波长：273nm；柱温：25℃；灵敏度：0.2 AUFS；进样量：20ml。

根据五种脱氧核苷在健康人体中的实际浓度，将本试验中脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷标准品的浓度范围定为1.0mmol/L～100.0mmol/L，5-甲基脱氧胞苷的浓度范围为0.05mmol/L～5mmol/L。配制五种不同浓度的混合标准样品（5-甲基脱氧胞苷0.05mmol/L，0.25mmol/L，0.5mmol/L，2.5mmol/L，5mmol/L；其它四种脱氧核苷1mmol/L，5mmol/L，10mmol/L，50mmol/L，100mmol/L），用于制备标准曲线。经各脱氧核苷标样单组分及混合组分的HPLC分析，各脱氧核苷标样单组份洗脱峰的保留时间与混合标样中各组份洗脱峰的保留时间基本一致。

1.5 统计学分析

以5-甲基胞苷的含量占总胞苷的含量之比（5-^mC／5-^mC＋dC）代表基因组中5-^mC的含量，结果用SAS统计软件处理，用方差分析中均数的两两比较（Student Newman Keuls Test）法计算6组均数之间的差异，t检验计算男女性别之间的差异。

2 结 果

2.1 五种脱氧核苷标准品的HPLC分析

各组份的出峰时间分别为：脱氧胞苷2.94min；5-甲基脱氧胞苷4.31min；脱氧腺苷6.73min；脱氧鸟苷10.42min；脱氧胸苷16.45min（图1）。通过每种标样不同浓度所得的各脱氧核苷HPLC峰面积经过回归分析，建立每种脱氧核苷峰面积与浓度之间的直线关系式（表1）。

表1 脱氧核苷测定的定量工作曲线

Table 1 The calibration curves of deoxynucleosides

脱氧核苷	工作曲线	相关系数r
dC	Y=-5.101e+004+9.091e+004X	0.999903
5-^metC	Y=4128+7.409e+004X	0.999917
dA	Y=-5.755e+004+6.171e+004X	0.999896
dG	Y=-5.752e+004+6.876e+004X	0.999880
dT	Y=-8169+4.81e+004X	0.999608

图1 五种脱氧核苷标准品的色谱图

Fig. 1 The chromatogram of mixtures of deoxynucleoside standard samples

2.2 样品的HPLC分析结果

将样本HPLC洗脱峰的保留时间与标样的保留时间比较确定每个组份峰（图2），再根据标准曲线换算得出样品中脱氧核苷的浓度，经统计计算得出每组5-^metC相对含量的均值及标准差，测得5-^metC的相对含量最小为2.08%，最大为4.93%（均值±标准差：3.41%±0.04%），＞60岁组5-^mC含量最低（表2）。50岁～60岁组和＞60岁组间的5-^mC含量差异不显著，但与其它四组有显著的统计学差异（P＜0.0001）；其余四组之间没有差异。男性（n＝50，3.5%±0.005%）与女性（n=44，3.32%±0.006%）之间无统计学差异（P＝0.1235）。

表2 人外周血白细胞基因组DNA中5-^mC相对含量

Table 2 5-^mC content in genomic DNA of human peripheral leukocytes

组别	年龄（岁）	例 数	^metC/^metC+dC（%）	P值
1	＜20	15（9男，6女）	3.910±0.038	＜0.0001
2	20～30	19（10男，9女）	3.530±0.060
3	30～40	14（8男，6女）	3.630±0.044
4	40～50	11（6男，5女）	3.560±0.054
5	50～60	16（9男，7女）	3.070±0.059
6	＞60	19（8男，11女）	2.960±0.022

图2 样品的色谱图

Fig. 2 The chromatogram of mixtures of deoxynucleosides in human peripheral leukocytes

图3 94例健康个体的年龄与5-^mC含量的散点图

Fig. 3 The scatterplot of 5-^mC content in 94 heathly donors based on age

3 讨 论

甲基化标记有传统DNA标记不可替代的作用，是遗传分析的又一重要工具。DNA甲基化水平随年龄变化这一现象很早即受到关注。许多研究均证实人和老鼠基因组DNA甲基化水平随着年龄的增加而降低^[7,8,9]，但其具体的下降程度尚不清楚，需要进一步的研究。

3.1 5-^mC含量与年龄的关系

本研究采用HPLC法检测不同年龄阶段的人外周血白细胞DNA中5-^mC含量，观察其动态变化过程。发现老年组（＞60岁）和50岁～60岁组5-^mC含量比其它四组均低，且有显著的统计学差异（P＜0.0001＝，与Globus^[7]等和Fuke等^[8]报道的结果一致。根据本研究的数据得出5-^mC含量随年龄以－0.014%/年的速度下降，比Wilson等^[9]报道的－0.004%/年和Fuke等报道的－0.001%/年大。其原因一方面可能是采用的方法不同，Wilson等^[10]检测的是体外培养细胞（成纤维细胞5-^mC含量约2.37%～3.00%），本研究检测的是体内白细胞（2.08%～4.93%）；另一方面可能是样本处理方法及测定条件不一致所引起的。尽管5-^mC含量随年龄的变化比较小，但有显著的统计学意义，这一方面说明人外周血白细胞基因组DNA中5-^mC的含量相对比较稳定，同时也揭示HPLC法的灵敏度较高。此外，Fuke等和Globus等均报道女性的5-^mC含量比男性的稍低，不同的是前者的差异有显著性（P＝0.0067）而后者的没有。本研究中男性5-^mC含量（3.5％±0.005％）的均值稍大于女性（3.32％±0.006％），但差异没有统计学意义（P＝0.1235）。这些研究结果与实际情况相矛盾，因为女性有一条失活的X染色体，是X染色体DNA CpG岛广泛甲基化的结果，其产生原因有待进一步的研究。

3.2 HPLC检测中应注意的问题

脱氧核苷的极性较弱，要求流动相的极性较高才能有效洗脱，极性越大出峰时间越快，但是极性大对色谱柱的损害也大，综合考虑选用0.1％（V/V）磷酸，五种组份均能有效分离。由于脱氧胞苷与5-甲基脱氧胞苷（约占总胞苷的4％）的浓度相差悬殊，要使两者较好分离，在选择检测波长和灵敏度的时候要慎重。本研究中当波长为254nm和273nm时都能分离，但是254nm时脱氧胞苷的峰面积与273nm时有明显差别，而5-甲基脱氧胞苷则保持稳定，故选择273nm。实验中保留时间对温度相当敏感，柱温每增加1℃，脱氧核苷的保留值就提前0.1～0.5min，因此实验过程的温度必须稳定。

本实验94份样本均在同一条件下测定，20分钟内五种脱氧核苷全部洗脱，除五个组份峰外每个样本在17min左右还有一个小峰，经证实为杂峰，可能是实验试剂引起的。部分样本测定了2次，结果基本一致，重复性较好。检测过程中，每天均复验空白对照和标准混合样品，以保证结果的准确性。实验中发现未避光保存的脱氧核苷标准样品重复检测的结果明显改变，而采取了避光措施的样本则基本不变，提示样本应避光保存。

HPLC法是目前检测5-^mC总量最可靠的方法之一，但无法了解甲基化的位置和状态信息，而在实际应用过程中常常需要知道具体某个位点的甲基化状态，这在一定程度上限制了其在DNA甲基化领域中的应用。年龄推断是法医学的主要任务之一，尽管人外周血中5-^mC的含量随年龄变化不大，但可作为一个参考因素加以考虑。

【参 考 文 献】

[1] Laird PW. The power and the promise of DNA methylation markers [J]. Nature Rev Cancer, 2003, 3: 253-266.

[2] Brena RM, Huang TH, Plass C. Quantitative assessment of DNA methylation: potential applications for disease diagnosis, classification, and prognosis in clinical settings [J]. J Mol Med, 2006, 84 (5): 365-377.

[3] Liu L, Wylie RC, Andrews LG, et al. Aging, cancer and nutrition: the DNA methylation connection [J]. Mech Ageing Dev, 2003, 124 (10-12): 989-998.

[4] Richardson B. Impact of aging on DNA methylation [J]. Ageing Res Rev, 2003, 2 (3): 245-261.

[5] Sakamoto Y, Ichimu