利用DNA推断血痕形成时间可行性方法

的探讨及其应用前景

杨利军1，依伟力1，隋景山2

（1．中国刑事警察学院法医系，辽宁 沈阳  110035；

2．秦皇岛市公安局海港分局 ，河北 秦皇岛 066000）

[摘要]  图像分析技术、单细胞凝胶电泳技术、流式细胞仪技术以及脱氧核苷酸末端转移酶技术都是现代生物医学领域的最先进的研究方法和定量技术，本文对上述几种研究方法测定DNA含量以及标记其降解程度的原理、机体死后细胞核DNA降解的规律以及利用上述研究方法推断血痕形成时间的应用前景进行了综述。

[关键词] 图像分析技术；单细胞凝胶电泳技术；流式细胞仪；血痕形成时间；DNA

死亡时间(Post  Mortem  Interval,PMI)和损伤时间（dating  of  injuries）的推断一直是法医检案及刑事侦查工作的重点和难点之一。在刑事案件中伴随损伤和死亡的发生一般都伴有血液的血痕的形成，这样推断血痕的形成时间就可以间接推断损伤和死亡的时间，国外的学者已经就这方面做了一定的研究，如Anderson S[1]等利用RT---PCR技术来推断血痕的形成时间以及Andrasko J[2]利用HPLC(高效液相色谱)的方法来推断血痕的形成时间,取得一定的进展，但是国内目前还未检索到这方面的研究报道，本文旨在探讨几种最新的测定DNA含量及其降解程度科学研究方法,以期能在以后血痕形成时间的研究上有所突破。

1图像分析技术（LAT）

图像分析技术（Image Analysis Techniqe,LAT）是在20世纪50年代发展起来的一门集计算机技术、数学形态学法原理，客观准确地以数据形式表达图像各种信息的技术。图像分析系统（Image Analysis System,LAS）则是对图像信息的收集、处理、测量、计算、分析，并得出图像各部分数量变化的分析仪器。它广泛用于天文、地理、地质、金属、纺织、材料、集成电路、生物和医学等各个领域中[3]。在生物医学领域，通过形态定量和图像分析，从宏观到微观，从大体到显微镜，甚至亚显微及分子水平，阐明形态与功能、形态与诊断、形态与疾病病因和预后、形态与发病机制等的内在联系。60年代末期，由Wield等开发的TICAS(Tax---onomic Intracellular Analytic System)最先用于宫颈涂片的研究。随着计算机技术的发展，现在已出现了全自动的彩色图像分析仪，并在血液白细胞的自动分类，肺癌、宫颈癌、胃癌等肿瘤细胞的自动识别，癌前病变的分级，细胞记数，纹理分析，病理图像检索等方面的应用越来越广[4]。2000年刘良[5－8]等首次报道了应用LAT测定大鼠脑、肝、肾、脾、肺、心肌细胞DNA含量的变化与死亡时间之间关系的研究，对用LAT推断死亡时间作了初步的探索，发现利用LAT测定细胞核DNA各种参数变化，对于推断死亡时间有一定的优势。血液一旦离开人体其血细胞(红细胞除外)中的DNA就开始被破坏和降解，所以LAT有可能成为推断血痕形成时间的新方法。尽管图像分析技术（LAT）有可重复性好、操作简单等优点，但是也受到多种因素的影响如现色的时间、图像和数据的处理等，所以用图像分析技术（LAT）推断血痕形成时间应尽量避免上述因素的影响。

2 单细胞凝胶电泳技术（SCGE）

单细胞凝胶电泳(SCGE),又称彗星试验(cometassay),是由Ostling和Johanson[9]于1984年建立起来的一种检测单个细胞DNA损伤的定量方法,是目前遗传毒理学中检测DNA损伤的经典方法。该方法通过观察凝胶中单个细胞核ＤＮＡ电泳特征直接分析核DNA的降解程度，降解的DNA片段在电场中向正极移动，形成“彗星”形图像。彗星尾部的光密度代表降解ＤＮＡ片段的量，尾长度则与降解DNA片段的大小有关。通过测定DNA迁移部分的光密度和迁移距离可以推定DNA的损伤程度。SCGE技术自出现以来,很多研究人员都致力于其应用与开发研究，包括试验条件的完善、专用图像分析系统的设计等。目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国KineticImaging公司的KOMET和德国Zeiss公司的KS400分析系统，但这些软件均需与其相应的仪器设备配套使用，价格十分昂贵，因此，我国大部分研究人员均采用荧光显微镜下根据损伤程度分级和目镜测微尺测量彗星长度的方法，这类方法虽然方便实用,但其主观性强、定量化程度不够。中山医科大学籍涛等人研制了一种新型的SCGE分析系IMI1.0，它比Zeiss公司KS400彗星分析系统使用更为方便、分析速度更快、结果准确、更便于统计分析,并具有多光谱融合功能、中英文可切换界面和多格式输出打印的特点[10～11]。何远[12]等认为利用单细胞凝胶电泳可直接检测死后细胞核DNA的降解情况，且尾长、尾矩与死亡时间相关性良好,可用于死亡时间尤其是早期死亡时间的推断，而且多方面的研究认为SCGE检测DNA的损伤非常敏感,每109Ｕ相对分子质量中有0.1个DNA的断裂都能被检测出来[13]，所以笔者认为在血量非常少的刑事案件中，利用SCGE对血痕的形成时间进行推断有可能是一种灵敏可靠快速的检测方法。

3 流式细胞仪技术（FCM）

流式细胞仪( Flow  Cytometer , FCM) 亦称荧光激活细胞分类仪(FACSC) , 是20 世纪70 年代发展起来的一种快速对单细胞总量分析和分选的新技术，是一种将现代免疫荧光技术与流体力学、激光学、应用电子学和计算机等学科的先进技术相融合用于基础与临床细胞生物学研究的一项高科技实验设备[14]。其原理是把待测细胞制备成单个细胞的悬液, 经特异性荧光染色后放入样品管中, 在清洁气体的压力下, 样品进入流动室, 流动室内充满鞘液, 在鞘液的约束下, 细胞排列成单列一个跟一个地在鞘液包围下由流动室下面的喷嘴喷出, 成为细胞溶液柱。液柱与垂直入射的高度聚焦激光相交, 细胞的散射光和激发产生的荧光被系统收集, 由检测系统转换为电信号, 各参数经计算机储存后用相应的应用软件进行分析处理, 即可得到有关的信息。因其测量速度快，且能对细胞进行分类测量，因而在DNA定量测定中得到广泛应用。1989年国内齐凤英[15]报道了使用FC定量检测大鼠死后DNA含量变化。1994年Cina[16]等又使用FCM研究了人体尸检材料脾组织DNA含量变化与死亡时间的规律关系。FCM 的优点是可以对单个细胞或其它生物微粒，进行快速定量分析及分选的技术，具有分析的多参数性、快速性及分选的高纯度性等特点，在医学领域中得到越来越广泛的应用。通过以上分析可以看出FCM对血痕时间的推断将有非常好的前景。

4 脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)技术

脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一种DNA聚合酶，它可以不需要模板的存在而催化游离的脱氧核苷酸插入到DNA链的3’-OH 末端[17] 。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端就可以在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-OH，从而可进行凋亡细胞或降解细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或降解细胞核进行原位染色，能准确的反应调亡细胞或降解细胞最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡或细胞降解测定，并可检测出极少量的凋亡或降解细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。尽管TdT法在细胞调亡的研究中应用较多，用于法医领域的比较少见，但是内源性DNase在调亡细胞的DNA的降解中起了主要作用，并且在死后细胞自溶DNA中也起到了与其相当的作用。调亡细胞的DNA降解和机体死后细胞的DNA等的降解都是酶解的过程，最后的结果是一样的，即DNA降解后DNA的片断数不断增加，DNA的5，末端和3，末端的数量也随之增加，因此从理论上说TdT法也可以用于机体死后细胞DNA降解的检测。2005年张岚[18]等应用TdT法进行了死亡时间的推断，结果证实TdT法确实可用于死后不同时间段DNA降解规律的研究，此变化规律可用于机体死亡时间的推断。TdT法检测的对象是DNA提取液，DNA提取液相当于浓聚了的细胞核DNA，因此可以更为准确的敏感的检测DNA的降解，可消除在图像分析检测DNA降解上的误差，而且TdT法提取DNA 技术比较成熟，分析仪器操作简单，敏感性较好，个体差异影响不大等优点，所以笔者认为该方法可为早期死亡时间的推断和血痕形成时间的推断提供一个可行性的方法。

5 利用DNA推断血痕形成时间的应用前景

DNA作为生物体内的遗传物质，其含量是相当稳定的。1948年Vendrely[19]最早研究了牛、猪、豚鼠组织细胞核DNA的含量，发现各种生物的DNA平均含量基本相同。此后1949年 Ris和Mirsky[20]，也明确地支持了这一观点。1955年年Vendrely[21]总结了以往工作，并进一步证实所有物种的体细胞中每个核的DNA平均含量相同。在细胞供氧不足的情况下，胞浆内的溶酶体通过各种机制而发生破裂，酶大量释放，加之细胞内酸性代谢产物的堆积，细胞内pH值下降，使溶酶体酶被激活而致细胞形态结构崩解，此即为细胞死亡后自溶的过程。在脱氧核糖核酸酶的作用下，核染色质双螺旋结构破坏并崩解成小碎片，同时由于核膜的破裂，DNA碎片分散于胞浆内，最后其中的蛋白物质被各种蛋白酶分解，核内物质消失，并且死后时间或组织离开机体时间越长，核酸被分解越多，直至消失。核表现为核浓缩，核碎裂，核溶解，而且随着DNA高特异性显示方法如，LAS、SCGE、FC以及可以显示DNA降解程度的TdT法的建立为DNA含量或降解程度与血痕形成时间关系的建立奠定了基础。但在这些技术成为成熟的技术方法之前，有些问题必须提请有关研究者的注意。这些问题涉及两个方面：一是实验条件的控制如实验条件的环境温度[22 23 24]、细菌繁殖[25]、血痕的载体、个体的差异等等因素都可以影响DNA的降解速率；二是数据的处理和应用中存在的问题。随着研究的不断深入、数据资料的积累，这些问题都将大部分得到解决。

综上所述，以上介绍的LAT、SCGE、FC、TdT技术方法以及如Anderson S[1]等利用RT－PCR技术来推断血痕的形成时间的技术方法以及Andrasko J[2]利用HPLC(高效液相色谱)推断血痕形成时间的方法即可以单独用于DNA含量或DNA降解程度的测定，也可以联合应用，1999年王慧君[24】等应用LAT和FC对DNA含量变化与死亡时间的关系进行了研究，其结果与其他学者报道一致，并认为高温可以加速DNA的降解，而骨骼肌因其制样困难不适宜于FC分析。虽然目前利用DNA含量或DNA降解程度推断血痕形成时间只是处于理论和实验研究阶段，但相信随着问题的逐步解决，上述方法将成为集客观性、精确性、智能化、自动化于一身的得力工具，在法医学实践中的应用将是十分广阔的。

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