单细胞凝胶电泳技术在推断血痕遗留时间中的应用

赵怀志，依伟力

（中国刑事警察学院法医学系，辽宁 沈阳  110035）

摘  要  血痕在犯罪现场是非常常见的物证，对血痕的检验主要是对血痕形态、形成原因、机理及血型、血清型、各种酶型以及脱氧核糖核酸等检验。目前对于不具备可以比较准确推断死亡时间的尸体或无尸体的现场，要求通过血痕推断形成时间进而推断杀人时间则比较困难。单细胞凝胶电泳技术已经成功应用于单细胞DNA降解的检测，为推断血痕遗留时间提供了一个可行的方法。本文总结国内外的理论与实践，阐述单细胞凝胶电泳技术在推断血痕遗留时间中的应用价值，以期为今后的深入研究工作提供参考。

关键词  血痕遗留时间；单细胞凝胶电泳；DNA 降解；法医病理学

血痕在犯罪现场是非常常见的物证，目前对血痕的检验主要是依据血型、血清型、各种酶型以及脱氧核糖核酸（DNA）等检验结果进行个人识别[1]。

作案时间或死亡时间的推断是侦查工作的最重要和基本要求之一。只有确定了案件发生的时间，才能围绕这个时间段查找嫌疑人，排除无关者，缩小侦察范围，从而节省人力、物力和时间。对于没有及时被发现的凶杀现场或没有尸体的杀人现场，通过推断现场血迹的遗留时间进而推断死亡时间或犯罪时间则具有重要的侦查意义。虽然国内外很多专家学者在推断血痕遗留时间方面做了许多工作，但仍不能准确地确定血痕遗留时间。

1 血痕遗留时间的国内外研究现状

二十世纪七十年代，曾有学者对血痕中的无机元素如氯、铁、磷、铜、硫等元素进行测定，希望通过观察它们的变化来推断血痕遗留时间，但是由于无机元素不易受环境因素影响，发生变化的幅度太小，无法应用[1]。还有的学者通过分光光度计测量血痕的色度、色调，利用计算机进行分析[2、3]，或测量血痕中酶的活性 [4]，或用免疫电泳法检测血浆蛋白的降解[5]来推断血痕遗留时间，也都无法实际应用。二十世纪九十年代，一些学者开始应用高效液相色谱（HPLC），通过检查血痕中各种蛋白的变化，探讨血痕中蛋白的降解规律，根据其规律推断血痕遗留时间[6、7]。进入二十一世纪，有学者采用半定量的RT-PCR技术测定血痕的RNA降解速度[8]、或用电子顺磁共振（EPR）的方法推断血痕遗留的时间[9]。但由于HPLC、RT-PCR、EPR等方法研究的血痕遗留时间因随时间变化不明显，少者几周，多者几百天，对较长的血痕遗留时间推断才有价值，在推测短期内的血痕遗留时间应用价值、实际意义不大。所以法医工作者日益认识到推断血痕遗留时间需要一个客观指标，这个指标必须与血痕遗留时间的延续具有较高的相关性，且不受或尽量少受外界因素影响。血痕中淋巴细胞核DNA的变化正是这样一类客观指标。

2 通过SCGE检测DNA降解推断血痕遗留时间的可行性

1955年Vendrely等总结了以往工作，并进一步证实存在于活细胞核中的DNA是一类具有显著生化稳定性的物质，在同一物种的不同组织的细胞核中，DNA含量是恒定的[10]。Nunno Nunzio R.D等的研究进一步表明，细胞核中的DNA于死后开始自溶性降解，3天内受环境温度与死亡方式影响较小，随着死亡时间的延长DNA含量逐渐下降[11]。因此研究血痕中淋巴细胞核DNA降解规律与血痕遗留时间的关系有重要价值。

目前，据细胞核DNA降解推断死亡时间有用显微分光光度计[12]、流式细胞术[13]、图像分析系统[14]等方法的研究报道。但上述方法均是通过测量死后细胞内DNA含量变化，间接推测细胞核DNA降解过程，而单纯DNA含量的变化不足以反映其死后降解的特征，应从更深一层次——DNA结构的改变进行探讨，检测并反映死后DNA降解的确切时间。

单细胞凝胶电泳技术(Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE)能够直接监测死后DNA的降解。单细胞凝胶电泳起源于1978年Rydberg和Johanson[15]报道的无电泳的单细胞凝胶分析，后来该技术被进一步发展为微凝胶电泳分析。Ostling[16]1984年以变性剂和高浓度盐使细胞溶解，然后在中性条件下电泳。Singh等[17]于1988年进一步发展了此技术，使细胞在碱性条件下电泳，这大大提高了分析的灵敏度，不仅可以检出双链断裂，还可以检出单链断裂及碱易变位点，因此被广泛采用。与传统方法相比，单细胞凝胶电泳技术具有敏感、简便、快速、低耗、重复性好等独特优点，并可直接观察单个细胞内的DNA损伤，因而迅速成为近年来最流行的DNA损伤检测方法而应用于遗传毒理学[18]、辐射生物学[19]、肿瘤学[20]、老年学[21]、环境生态学[22]、法医学[23]等领域。2002年，laura A.Johnson首次报道了应用SCGE分析离体猪血液淋巴细胞核DNA降解规律的研究[24]，证实应用SCGE技术推断血痕遗留时间的可行性和指标客观性。

3 SCGE技术推断血痕遗留时间的特点

SCGE对血痕中淋巴细胞核DNA降解的研究不只停留在“有”或“无”的阶段，而更进一步深入到对降解发生过程细微改变的动态研究，以及对不同死亡时间的细胞降解的定性和定量研究。同时由于现代计算机技术的不断发展，各种专业的图像分析软件逐步被开发，使SCGE的检测功能不断完善和多样化，成为研究血痕遗留时间的极为有利的手段和极为特异的方法。

4目前研究中存在的问题和展望

（1）由于SCGE技术作为一种新生技术，其应用潜力尚未得到国内法医界的普遍重视，故目前国内尚未有报道应用SCGE技术检测血痕中淋巴细胞核DNA降解的研究。

（2）SCGE技术具有一系列的优点，因此，以彗星分析为手段进行的研究越来越多，使用该方法的实验室也越来越多.但也存在一些问题：一是进行彗星分析的实验室很多，但条件不尽相同，如不同实验室实验条件、操作方法差异极大不同，包括溶解液、电泳液的配方，溶解时间、电泳参数、 DNA 结合荧光染料的选择都远远没有标准化，从而导致评价各实验室结果尚无统一标准，这就使得不同实验室的彗星分析结果可比性较差；二是彗星分析的参数较多，到目前还没有一个统一的DNA损伤判断标准，还存在不同类型细胞实验结果的不一致性；三是荧光显微镜及图象分析仪价格较高对本法的普及应用造成一定的困难。相信随着科学技术的进步，这些问题终将解决。

（3）虽然细胞核DNA降解受外界环境影响较小，但影响血痕淋巴细胞核DNA降解的各种条件，如温度、湿度、不同载体、死前疾病等，究竟对淋巴细胞核DNA降解有何影响，还无法予以周详的考虑。

如上所述，采用单细胞凝胶电泳技术，为寻求一种客观准确、经济实用、简便快速、重复性好的推断血痕遗留时间的实验方法打下了较好的基础，同时此技术可以在单细胞水平监测血痕中淋巴细胞核DNA变化，对降解发生过程细微改变进行动态研究，在单细胞水平对血痕遗留时间进行定量研究。因此其在法医学实践中的应用将是十分广阔的。尽管目前应用SCGE技术推断血痕遗留时间，还不能完全可靠而又精确地运用于法医实践中，但其预期成果是令人鼓舞的，如果能在此基础上进行大量研究，并仔细考虑环境等外部因素后进行综合分析，不断增加数据资料，建立数据库并开发智能软件，就可以使SCGE技术推断血痕遗留时间更趋近准确、实用。

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