线粒体DNA（mtDNA）PCR-SSCP分析方法研究

侯光伟  姜先华  刘锋  黄斌  于蛟

（辽宁省刑事科学技术研究所，辽宁 沈阳 110032）

[摘要]目的 研究法庭科学中微量生物物证的mtDNA PCR-SSCP个体识别方法，建立适合微量生物物证筛选并且快捷、经济的mtDNA PCR-SSCP分析方法。方法  应用PCR和SSCP技术选择mtDNA D－loop区的HVI 16030-16481区域(452 bp)作为分析目标对中国汉族125名无关个体群体进行了调查。结果  对125名无关个体血迹样本进行SSCP电泳分析的结果表明，不同个体mtDNA构像单倍型具有丰富的多样性，共计发现96种单倍型，其单倍型多样性为99.48%，两个无关个体的偶合机率为 1.31%。结论本研究为法庭科学中不能进行核DNA分析的大数量微量生物物证鉴定工作提供了一种快捷、经济的筛选方法。

The PCR-SSCP method of mitochondrial DNA (mtDNA) /Hou guangwei, Xianghua Jiang,Liu feng, Huang Bin,Yu jiao /Liaoning Province Criminal Science and  Technology Institute, Shenyang  110032

[Abstract] Objective  To study individual identification method of mtDNA PCR-SSCP from trace biological samples in forensic science,and to set up a rapid and economy SSCP method adapting to screen trace samples. Methods  The PCR and  SSCP technology were applied, and the  HVI 16030-16481 region of  mtDNA D-loop was  selected as an analyzed indicator.125 unrelated individuals’bloodstains from China Han population were investigated.Results The results of SSCP of 125 bloodstains showed that a high polymorphism was observed among mtDNA hyplotypes of this population, and 96 hyplotypes were observed, with a polymorphic diversity of 99.48 and a random matching propability of 1.31%. Conclusion A rapid and economic method was established in our study to screen multitude trace samples which cann’t be analyzed by nuclear DNA methods.

[Key words]  Forensin Science; Mitochondrial DNA（mtDNA）；PCR-SSCP； Individual identification

[关键词] 法庭科学； mtDNA； PCR-SSCP；个体识别

  

在法庭科学生物物证的鉴定工作中，经常遇到毛干、指甲、陈旧骨骼等微量生物物证，这类物证共同特点是不含核DNA(nDNA)或含量极微，使用成熟的多色荧光STRs技术检测常常失败，一般只能依靠mtDNA测序方法解决。由于测序方法操作复杂、费用昂贵，当需要同时对同一案件中数十份以上大数量无nDNA微量生物物证测序分析时，往往涉及费用和时间问题，普通DNA实验室难以承担。这种情况下，毫无目的地使用测序方法对犯罪现场物证及随后的嫌疑人样品进行海量排查，无疑是一种不必要的浪费。因此，寻找一种经济、快捷的筛选方法以解决这类大数量物证测序之前的排查问题无疑具有重要的实用价值。本文采用PCR－SSCP技术对mtDNA D－loop区的HVI 16030-16481区域进行相关研究，现报道如下：

1         材料和方法

1.       1样本

1.1.1        125份无关个体血迹样品

     取125名中国汉族无关个体新鲜血液各约2ml涂在血纱布上制成。

1.1.2  MtDNA PCR-SSCP 构像单倍型 Ladder制备   通过MtDNA  SSCP电泳筛选出具有不同单倍型的3个无关个体DNA样品，等比例混合后取适量扩增而成.

1.2 方法

1.2.1扩增模板的制备

    取血迹样品适量，加入100ul 5%chelex-100，震荡混匀后放入 56℃水浴1 h后取出，震荡10s，100℃水浴8min，震荡10s，离心备用。

1.2.2 引物的设计与合成

 扩增mtDNA D－loop HVI 16030-16481区域452bp片段引物的设计与合成

根据Anderson等报道的mtDNA碱基序列设计，引物序列如下：

     引物1：5＇－TTCTCCATTAGCACCCAAAT－3＇

引物2：5＇－TTAGCAACCCCCAAGTGC－3＇

 

1.2.3 mtDNA-HVI16030-16481区域452bp片段的PCR扩增及检测

mtDNA扩增所应用试剂为宝生物公司产品,扩增体系为50μl，包括200µMdNTP、1.5mM MgCl2 、10Xbuffer5μl 、引物1、2混合物（2.5pmol/μl）5μl , Taq酶1.3U, chelex-100处理后的样品5μl作为 DNA模板

在PE公司2400扩增仪上扩增，扩增条件为94℃变性3min,再于94℃变性30S,55℃退火60S,72℃延伸90S,循环35次,最后于72℃恒温10min,4℃保存。

mtDNA特异扩增片段的检测：取扩增产物5μl，2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，在紫外检测仪下检测。

1.2.4 mtDNA-HVI16030-16481区域452bp片段产物的SSCP电泳分离及结果观察

  使用凝胶浓度为8%，交联度为44.4：0.88含10%甘油、0.5×TBE电泳Buffer的PAG凝胶，规格为 16cm×14cm×0.1cm。吸取扩增产物12μl与3μl含甘油的载样Buffer混匀沸水浴10min后上样，在5℃的环境中恒电压500V电泳18小时。SSCP电泳结果观察采用银染色方法。

1.2.5 mtDNA单倍型统计及多样性评估

   mtDNA-HVI 16030-16481 SSCP结果的单倍型根据本研究制备的单倍型 Ladder判定；单倍型多样性根据公式h＝（1－∑x2）*n/(n-1)计算，其中n是样本数量，x是每一个mtDNA单倍型的频率[1]。

2 结  果

2.1 中国汉族无关个体mtDNA-HVI 16030-16481区域452bp片段的检测


   对125名无关个体血迹样品进行mtDNA-HVI 16030-16481区特异性PCR扩增452bp片段，均获得满意结果，其中部分个体的检测结果见照片1：

C+   1    2    3    4    5    6    7   8    9   10   11   12   13  14  15   16  

照片1无关个体血迹样品mtDNA 452bp特异性片段的检测结果

注：C+为452bp已知对照样品

Photo 1. The detection results of mtDNA 452bp specific fragment of  bloodstain samples from 16 unrelated individuals

   c＋：one known 452bp sample

2.2 中国汉族无关个体mtDNA-HVI 16030-16481区域452bp片段的SSCP多态性

  对125名中国汉族无关个体样本进行SSCP电泳分离，123名个体获得4条特异性谱带，2名个体获得3条特异性谱带不同个体mtDNA构像单倍型具有丰富的多样性（照片2），共计发现96种单倍型，其单倍型多样性为99.48%，两个无关个体的偶合机率为 1.31%，可将绝大多数样品区分开来。


          1   2    3    4    5    6    L    7    8    9    10   11

照片2. 11名无关个体 mtDNA-HVI 16030-16481区域PCR-SSCP结果

Photo 2. The PCR-SSCP results of mtDNA-HVI 16030-16481 from 11 unrelated individuals

 

3 讨   论

单链构像多态性分析技术（SSCP）是依据具有相同片段长度而碱基序列不同的DNA片段变性后，经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离将产生不同构像的单链谱带从而具有构像多态性，分析的灵敏度可达一个碱基差别。在法庭科学领域国内外学者有关mtDAN SSCP研究的报道比较少。西班牙学者Salas A等于2001年报道了应用重叠片断荧光SSCP(Fluorescent SSCP of overlapping fragments)分析mtDAN变异的方法。应用这种方法区分序列互不相同两个体的能力接近100％[1]。西班牙学者Barros F等在1997年对mtDNA酶切后产物进行SSCP分析序列多态性的报道。当使用MspI and HinfI 两种内切酶后，获得的个体识别能力可达90％[2]。1996年学者Alonso A 报道了应用SSCP方法对45名西班牙个体进行mtDNA对照区HVI、HVII区域分析的结果, HVI区域观察到11种单倍型，HVII区域观察到10种单倍型[3]。本研究选择碱基变异比较丰富的mtDNA 16030-16481区域作为分析目标区域。对125名中国汉族无关个体样本进行SSCP电泳分析的结果表明，不同个体mtDNA构像单倍型具有丰富的多样性，共计发现96种单倍型，其单倍型多样性为99.48%。证明这种方法是进行不能进行核DNA分析的大数量样品筛选的一种快速、经济的方法，可以节省大量的测序工作和费用。本研究对125名中国汉族无关个体样本进行SSCP电泳分析的结果表明，不同个体mtDNA构像单倍型具有丰富的多样性，共计发现96种单倍型，其单倍型多样性为99.48%；

此外，经SSCP电泳分离约有98%的单一无关个体可以获得4条谱带，这与理论上mtDNA 的SSCP结果应为2条谱带有些差别，但经过对多个样品的4条谱带回收、测序与原样品序列比对，序列结果与原样品一致，证明均是特异性谱带。造成4条谱带的可能原因是在SSCP电泳过程中部分单链mtDNA发生复性重新结合成双链引起电泳迁移率变化，从而在不同位置额外产生2条谱带，但是这并不影响其对混合血迹样品的分离及作为一种单一个体识别的筛选手段。

   本研究建立的mtDNA PCR-SSCP个体识别方法经济、快捷，非常适合大数量无核DNA微量生物物证测序分析前的筛选工作，在生物物证鉴定工作中必将发挥重要作用。

 

                           参  考  文  献

1、顾名波，柳杰，杜庆新，等. 中国汉族人群的线粒体DNA控制区多态性研究[J].  中国法医学杂志，2001，16（1）：6

2、Salas A, Rasmussen EM, Lareu MV, Morling N, Carracedo A. Fluorescent SSCP of overlapping fragments (FSSCP-OF): a highly sensitive method for the screening of mitochondrial DNA variation. Forensic Sci Int. 2001 Dec 27;124(2-3):97-103.
3、Barros F, Lareu MV, Salas A, Carracedo A.Rapid and enhanced detection of mitochondrial DNA variation using single-strand conformation analysis of superposed restriction enzyme fragments from polymerase chain reaction-amplified products. Electrophoresis. 1997 Jan;18(1):52-4.
4、Alonso A, Martin P, Albarran C, Garcia O, Sancho M.Rapid detection of sequence polymorphisms in the human mitochondrial DNA control region by polymerase chain reaction and single-strand conformation analysis in mutation detection enhancement gels. Electrophoresis. 1996 Aug;17(8):1299-301.
Alonso A, Martin P, Albarran C, Garcia O, Sancho M.