福尔马林固定石蜡包埋组织小片段STR分型

谭卓毅，丁梅

（中国医科大学法医学院法医血清教研室，辽宁  沈阳 110001）

[摘要]  目的：探讨对福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues FFPET）进行小片段STR位点分型的可行性。方法：采用二甲苯脱蜡法，蛋白酶K消化和有机提取法制备FFPET的DNA模板，选用扩增片段长度较小的D8S1179位点（157bp～205bp）进行PCR扩增和PAGE分型。并通过对DNA模板进行稀释来降低其中PCR反应抑制因子的作用。结果：PCR扩增后出现假阴性结果，通过稀释其模板浓度可获得PCR扩增产物，但电泳谱带呈“涂布”状，不利于分型。结论：在对FFPET进行PCR-STR分型时，应尽量采用扩增片段较小的STR位点。对DNA模板中残留的PCR反应抑制因子，可以通过适当稀释来降低其抑制作用。

[关键词] 法医物证学；福尔马林固定石蜡包埋组织；PCR抑制因子；PCR-STR分型

 

     甲醛固定石蜡包埋组织（Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues FFPET）是医院病理科和法医鉴定机构档案中重要的个人实物档案,是可靠的分子生物学研究材料的来源, 同时也是医疗纠纷和一些刑事案件的重要证据，由于案情的需要,常需对FFPET进行个人识别。法医物证领域常用CODIS系统中的13个STR位点，其目的片段长度多在100bp～450bp,而FFPET中DNA高度降解，其DNA质量很难满足常规STR分型的需要；同时，FFPET制备的DNA模板中还存在一些有机法难以去除的、来源不明确的PCR反应抑制因子[1]，这也是造成其STR分型困难的重要因素。FFPET进行STR分型时出现的扩增成功率低，等位基因丢失和电泳分型时呈现“涂布状”或Ladder-Liking谱带等问题一直是学者们研究的热点[2]。本研究采用二甲苯脱蜡、蛋白酶K消化及有机法提取FFPET中DNA,选用目的片段相对较小的STR位点D8S1179进行PCR扩增和电泳分型（扩增片段长度为152bp～205bp），并试图通过稀释DNA模板来削弱PCR反应抑制因子的作用，旨在探讨采用小片段STR位点对FFPET进行DNA分型的可行性。

1 材料和方法

1.1  样 品 

共9个FFPET样本，分别取自3具尸体（A、B、C）的肺、心、脑,用普通福尔马林固定，固定时间约为7d，并分别采取2ml尸体心脏血液作为阳性对照。本研究所采用样本均来源于中国医科大学法医学院法医病理学教研室。

1.2  样品的预处理 

将FFPET制成7μm厚切片各4片，用镊子将其钳入1.5ml EP管中，分别用1mL二甲笨于65℃脱蜡两次，脱蜡时间为2h和12h。离心后，沉淀组织分别用无水乙醇和75％乙醇复水，并除去组织中剩余的二甲苯。干燥后，组织被浸泡于0.5ml消化缓冲液TES(15mmol/L NaCl + 15mmol/LTris-HCl + 15mmol/L EDTA,pH8.0),待组织松软。

1.3  蛋白酶K消化和有机法提取DNA 

向上述EP管中加入10%(W/V)SDS（终浓度0.5％）和20mg/ml蛋白酶K （终浓度0.2mg/ml），56℃消化至液体清澈透亮。然后采用有机法提取DNA，最后用50μl灭菌去离子水融解DNA沉淀，4℃保存备用。

1.4  DNA模板的质量检测 

本研究采用（型号）紫外分光光度计对所制备的DNA模板进行初步的纯度分析，按OD260×50ug/ml计算各DNA模板的浓度。然后将模板DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，选用已知DNA片段（333bp）作为参照，观察各模板DNA片段长度的分布区域。

1.5  DNA模板的倍数稀释

FFPET制备DNA模板各备5支0.2ml EP管，第1支和第2支分别加入32ul 灭菌去离子水，其余各加入20ul 灭菌去离子水，按图1所示进行稀释，然后4℃保存备用，以期比较其不同浓度下的PCR扩增效果。

       

图1 DNA模板的稀释

1.6  PCR扩增及电泳分型 

D8S1179的扩增产物为152bp～205bp，上游引物：5'TTTTTgTATTCATgTgTACATTCg 3',下游引物:5'CgTAgCTATAATTAgTTCATTTTC 3',20ul PCR反应体系：灭菌去离子水8ul, 10×PCR-Buffer 2ul,100 umol/L引物1.5 ul, 2.5mmol/L dNTP 1.5, 25mmol/L mg2+ 1.5ul, 0.5U/L Taq酶  2ul（购自华美生物公司），DNA模板2ul。PCR反应循环条件：95℃预变性2min，95℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min20s，30次循环后，72℃延伸5min。然后采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并银染显色分型。

 

2 结 果

2.1  紫外分光光度计检测结果 

各个样本OD260/OD280均分布在1.6～1.8，说明其中蛋白质和RNA含量均比较低，再按1 OD260=50ug/ml计算各DNA模板浓度，约140ug/ml～1g/ml。

2.2  1％琼脂糖凝胶电泳结果 

DNA模板用1%的琼脂糖凝胶进行电泳和Gene-finder染色，观察其DNA片段大小的分布范围(图1)。与333bp已知DNA片段相比较,所有样本的模板DNA片段主要分布在333bp以下。第二道为阳性标本的DNA模板带，其DNA模板相对完整。

 

图1 DNA模板经1％琼脂糖凝胶电泳

1：已知333bp的DNA片段作为对照；2：用尸体心脏血液制备的DNA模板；

3，4：用A号尸体的肺脏和心脏FFPET制备的DNA模板；5～7：用Ｂ号尸

体的肺脏、心脏和肝脏FFPET制备的DNA模板；8，9：用C号尸体肺脏和心

脏FFPET制备的DNA模板。                      

2.3  PCR-STR分型结果 

D8S1179位点的分型结果表明,在高浓度下，PCR扩增的阳性率（出现扩增产物）和产物量均低于较低浓度。个别样本在稀释100倍以后，其扩增产物量反而降低。而阳性对照未见明显变化，谱带均清晰可辨。通过与阳性对照相比较，各样本的主带附近可见到PCR扩增产物,但是谱带均宽而淡染,呈“涂布状”，难以分型。          

 

3 讨  论

FFPET一直是困扰广大法医工作者的疑难检材，在其制作过程中，需要经过福尔马林固定、水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡与石蜡包埋等，DNA在此期间因接触多种化学试剂和经历温度的变化而难免发生降解，继而造成PCR扩增和电泳分型的困难。其中最主要的影响因素是甲醛的作用，甲醛可引起生物大分子之间形成广泛的亚甲基交联桥，使DNA分子的脆性增加，在剪切力的作用下，DNA分子更易于断裂[3]。同时DNA与蛋白质之间经广泛交联后形成牢固的复合物，可阻碍蛋白酶对组织的消化，从而影响FFPET的DNA提取，还可进一步阻碍模板的变性和引物的退火与延伸。因此，本研究选用蛋白酶K的最佳活性温度（65℃）对样本进行消化，并增加蛋白酶K的有效浓度，以期获得最佳消化效果。另外，石蜡也是影响FFPET中DNA提取的重要因素，它可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。在DNA提取过程中，如未能有效去除石蜡，形成的DNA-石蜡混合液，不利于PCR扩增[4]。对此，根据盖宝东[5]等的报道，采用二甲苯的最佳脱蜡条件，对FFPET切片进行彻底脱蜡，去除石蜡对后续实验的影响。

本研究中选用9个FFPET样本所制备的DNA模板分别用紫外分光光度计进行检测后，所测OD260/OD280均分布在1.6～1.8之间，其值与阳性对照相当，提示蛋白质和RNA等杂质的含量比较低，应当不会影响PCR扩增反应，根据OD260计算所得模板量大致相当于0.6ml～5.0ml正常全血所提取的DNA量。然而后续PCR扩增的效果却不理想，谱带呈“涂布”状，无法判型。推测其原因可能主要来源于以下两个方面：

① FFPET中DNA高度降解。这是导致PCR扩增不理想和分型困难的主要因素，也是难以避免的。甲醛介导的DNA损伤，在固定3h后已明显发生。固定时间越长，甲醛所致的DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA。王剑等[6]采用Promega公司提供的Geneprint STR system 复合扩增试剂盒对FFPET进行STR分型后发现，固定时间超过72h的均无谱带出现。本研究为了让FFPET样本更具有代表性，按照中国医科大学法医学院法医病理教研室常规工序制作样本，即福尔马林固定7d左右。根据1％琼脂糖凝胶电泳结果，所提取DNA片段主要分布在333bp以下,表明DNA模板严重受损。

本研究选用了扩增片段相对较小的D8S1179位点，其扩增片段长度为152bp～205 bp。结果发现，各样本经不同浓度稀释以后，虽然都出现PCR扩增阳性结果，但是其PCR产物在主带附近呈“涂布”状分布，难以判型。而模板浓度与之相当的阳性对照却谱带清晰可辨。其原因可能是，FFPET的DNA模板在STR位点的核心序列上发生断裂，而引物结合部位却保持完整，PCR扩增早期引物可分别与断裂的DNA模板退火延伸，形成不完整的正向链与反向链，它们的核心序列部分可以在后续的循环中互为模板进行退火延伸，最终PCR结果出现长短不一的扩增产物。DNA片段长度越大，其损伤几率越大，扩增成功率越小。选择扩增片段更小的（小于150bp）STR位点可能会获得理想的PCR-STR分型结果。

    ②用FFPET制备的DNA模板中存在PCR反应抑制因子。FFPET制备的DNA模板中存在着一些不能通过蛋白酶K消化和有机法去除的PCR反应抑制因子，随FFPET检材量的增加，其抑制效果越明显[1]。例如，FFPET中DNA严重降解后出现的大量寡核苷酸碎片，在PCR扩增时，可竞争性结合反应体系中的Mg2+，降低Mg2+的有效浓度，从而降低Taq酶的活性，同时还可干扰引物与模板结合而降低PCR扩增效率。采用凝胶层析技术或Wizard DNA Clean-Up System等商品化DNA纯化试剂盒对FFPET制备的DNA模板进行纯化，可以明显改善其DNA质量[5]。

    本研究对FFPET制备的DNA模板进行了倍数稀释后进行PCR扩增与电泳分型，发现高浓度下无PCR产物的样本，在低浓度下可于主带区域见到“涂布”状扩增产物条带。这说明FFPET制备的DNA模板中存在着PCR反应抑制因子，通过可以稀释的方法来降低反应体系中PCR反应抑制因子的浓度，从而削弱其抑制作用，提高PCR扩增效率。该法与凝胶层析及其他商品化纯化试剂盒相比较而言，其简单易行，耗损小，便于常规应用与推广。至于这些PCR抑制因子的确切来源和作用机理则有待更加深入的研究证实。

综上，建议在对FFPET这种疑难检材进行STR分型时，应尽量选择扩增片段小于150bp的STR位点；在制备其DNA模板时，必需对检材进行彻底的脱蜡并优化其蛋白酶K消化条件；在PCR扩增前，需要采用合适的DNA纯化技术去除样本中的PCR抑制因子或通过适当的稀释来削弱PCR抑制因子的作用，从而有望提高其PCR扩增成功率和可靠的STR分型结果。

 

【参考文献】

[1] 田子强,刘俊峰,张少为,等.普通甲醛固定石蜡包埋组织提取方法的探讨 [J].癌症,2004,23(3):342-345.

[2] 楼迪栋，徐纯应，黄代新,等.降解检材STR分型Ladder-Like条带形成原因的探讨 [J].中国法医学杂志,2005,20(6):332-334.   

[3] Mies C, Houldsworth J, Chaganti RS.Extraction of DNA from paraffin blocks for Southern blot analysis [J].Am J Surg Pathol,1991,15(2):169-174.

[4] Lonn U, Lonn S, Nilsson B,et al. Demonstration of gene-amplification by PCR in archival paraffin-embedded breast cancer tissue [J].Breast Cancer Res Treat,1994,30(2):147-152.

[5] 盖宝东，房学东，金仲田.提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究 [J].吉林大学学报(医学版),2003,29(1):115-118.

[6] 王剑、顾明波、杜庆新，等.福尔马林固定石蜡包埋组织的PCR-STR分型 [J].中国法医学杂志,2002,17(3):169-170.

 

联系人：谭卓毅  或  丁梅教授 （主任）

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